לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי<em> תסיסנית</em> שחלות
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
המיטוכונדריה מתואר קלסי כמו תחנת הכח הסלולר, שכן הם המושבים העיקריים של ייצור אנרגיה בתאי בדיל. יתר על כן, המיטוכונדריה לשחק תפקיד קריטי במטבוליזם, דור חום, שינוי שומנים, סידן הומאוסטזיס חיזור, תזמור תהליכי איתות תא, וכו '1. המיטוכונדריה גם לשחק תפקיד פעיל האינדוקציה של מוות של תאי 2, כמו גם מחזור התא תקנה 3. רב-פונקציונלי כזו מעלה את השאלות העקרוניות הבאות: א) איך המיטוכונדריה אל לבצע את כל הפונקציות האלה בו זמנית ב) האם יש ברכות המיטוכונדריה ספציפיות או subzones כי הם מיוחדים עבור פונקציות נפרדות? בהקשר זה, חשוב לציין כי המיטוכונדריה רב התכליתית הן דינמיות הצורה, הגודל שלהם, ואת המבנה בתוך תאים בודדים וכי הצורה היציבה של המיטוכונדריה יכולה להשתנות בין סוגי תאים. עשרות שנים של מחקר ממעבדה שונהoratories מראה כי השינוי של צורת המיטוכונדריה, גודל ומבנו, דינמיקה המיטוכונדריה פנתה במשותף, הוא חיוני בשמירת פונקציות המיטוכונדריה שונה 4,5,6. ממצאים אלה מעלים את האפשרות כי המיטוכונדריה יכול להשיג רב הפונקציונלית שלהם מכוח הדינמי המבני שלהם.
מאמצים נרחבים נערכים להבין את הקשר מבנה-תפקוד המיטוכונדריה. הדינמי של מבנה המיטוכונדריה נשמר בעיקר על ידי היכולת שלהם לעבור אירועי ביקוע ואיחוי אחד עם השני. ביקוע של המיטוכונדריה גדול ממיר אותם אלמנטי המיטוכונדריה קטנים, תוך היתוך בין שני המיטוכונדריה קטן ממזג אותם לאלמנט המיטוכונדריה גדול 7. יתר על כן, היתוך חולף של שתי המיטוכונדריה עלול להתרחש כדי לאפשר הערבוב של תוכנם. אירועי הביקוע ואיחוי של ממברנות המיטוכונדריה הפנימיות וחיצוניות נשלטים בקפידה על ידי המפרטific קובע של חלבונים. מנגנון ביקוע הגרעין מורכב הקשורות dynamin חלבון 1 (Drp1), אשר גייס מן cytosol אל המיטוכונדריה ידי האינטראקציה שלה עם חלבונים המיטוכונדריה בתום לב מסוים (למשל, Fis1 או Mff1), בעוד פונקצית Drp1 יכולה גם להיות מוסדרת על ידי חלבונים אחרים על פני המיטוכונדריה 4. למרות Drp1 פועלת על הממברנה החיצונית, יכולות הביקוע שלה להשפיע על הקרום הפנימי גם כן. התזמור של הביקוע של ממברנות המיטוכונדריה חיצוניות ופנימיות אינו מובן היטב. מצד השני, פיוז'ן של הקרום הפנימי נשלט על הליבה על ידי הפעילויות של Opa1, בעוד mitofusins השולטים ההיתוך של 5-הממברנה החיצונית. יתרת אירועי הביקוע ואיחוי המנטרל של המיטוכונדריה להכתיב את צורת המיטוכונדריה היציבה בתא. לדוגמה, הדחקה של ביקוע המיטוכונדריה תביא היתוך שלם ללא התנגדות, בעוד יתר פעילות של המיטוכונדריהביקוע l יביא לפיצול של המיטוכונדריה 3.
המחקר של קשר מבנה פונקצית המיטוכונדריה כרוך בעיקר שתי גישות מחמיאות: א) מנתח של פנוטיפים הסלולר האורגניזם לאחר מניפולציה גנטית של חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה ב) הערכות ישירות של מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. ראוי לציין כי אנליזה גנטית לא תמיד לחשוף את הפונקציונליות הישירה של המולקולה בהישג היד (במקרה זה, חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה), כמו פנוטיפים שעלולים להתעורר עקב השפעות משניות. לכן, זה הוא בעל חשיבות עליונה לפתח ולהשתמש בכלים כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ישירות. כל הערכה של מבנה המיטוכונדריה כרוכה כלים מיקרוסקופיה שונים. שימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי חיים התקדם המחקרים מאוד של דינמיקה המיטוכונדריה, מאז הדינמיות המיטוכונדריה ניתן לנטר הן מבחינה איכותיות quantitatively באמצעות כלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתאימים וטכניקות 8. כלי מיקרוסקופיה קרינה מבוססות פותחו כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ברקמות תסיסנית חיות וקבועות, הבהרת המשמעות של הדינמיות המיטוכונדריה vivo 9. אלה ושיטות החישוב לסקר מתוארים כאן, עם המטרה של לימוד מבנה המיטוכונדריה ותפקוד בשחלה תסיסנית.
השחלה תסיסנית מורכבת שושלות בתאי מין וגם סומטיים, אשר נובעות בתאי גזע בוגרים שלהם שוכני germarium 10,11. שישה עשר בתאי הנבט סינסיציאלי (GCS) לקבל במארז ידי תאי זקיק סומטי (FCS) כדי ליצור תאי ביצה הפרט העולות מתוך germarium (איור 1). אחת מ -16 GCS לקבל מחויב להיות ביצית, ואת GCS 15 הנותר להתפתח לתאי אחות ששומרים על הגדילה של תא הביציתאת הקלת הבשלת הביצית לפני שהוא הניח. רוב FCS לעבור 9 סיבובים של חטיבות mitotic לפני שהם יציאת מחזור תא mitotic סופנים להתמיין שכבת תא אפיתל בדוגמת המורכבת תאי זקיק קדמי (AFCs), תאי זקיק אחורי (PFCs), ותאי גוף עיקריים (MBCs) . תאי הביצה הרצופים מחוברים באמצעות תאי גבעול, אשר הם מובחנים תאים נגזרים גם FCS בשלב המוקדם של התפתחות. צורת מיטוכונדריאלי מוסדרת על ידי Drp1 חלבון ביקוע המיטוכונדריה מעורב באופן פעיל בתהליך של התמיינות במהלך ההתפתחות הנורמלית של שכבת FC שחלות תסיסנית 9,12. שיטות שימוש במחקרים אלה כדי לזהות את המעורבות של Drp1 בפיתוח שכבת תאי זקיק תסיסנית מתוארות כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
Photobleaching: מניעת photobleaching מופרזת של דגימות ניאון הוא הכרחי כדי ביצוע מיקרוסקופיה confocal יעיל. לכן, הזמן שלוקח לאתר דגימות דרך העינית או להגדיר פרמטרים רכישת התמונה דרך במצב סריקה בזמן אמת צריך לה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
