The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.
The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.
लर्निंग स्मृति निशान और उनके रखरखाव के गठन पर आधारित है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि एक अंतर्निहित तंत्र न्यूरॉन्स के बीच मौजूदा synaptic संपर्कों के नए और / या पुनर्व्यवस्था की गतिविधि पर निर्भर गठन का प्रतिनिधित्व कर सकते। आणविक स्तर पर, विभिन्न प्रोटीन संशोधनों, subcellular relocalizations और synaptic प्रोटीन के कारोबार में परिवर्तन 1-4 (Lamprecht 2004 # 8) वर्णित किया गया है। हालांकि, ज्यादातर अध्ययनों से अब तक नहीं बल्कि वैश्विक लेकिन जटिल synaptic proteome रचना पर की तुलना में चयनित प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित किया। वर्तमान दृष्टिकोण एक सीखने प्रयोग के बाद माउस मस्तिष्क क्षेत्रों में synaptic proteome परिवर्तन के लिए एक निष्पक्ष जांच की अनुमति देता है। यह synaptic वास्तुकला के सीखने प्रेरित पुनर्गठन के समय बिंदु निर्भर आणविक स्नैपशॉट प्रस्तुत करने के लिए उपयुक्त है। वर्णित कार्यप्रवाह पशुओं के व्यवहार, प्रोटीन जैव रसायन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और bioi में विभिन्न विशेषज्ञों की एक विशेष टीम वर्क की आवश्यकता हैnformatics।
चुने सीखने प्रतिमान, यानी आवृत्ति संग्राहक स्वर भेदभाव (FMTD), एक अच्छी तरह से विशेषता मूषक 5 में श्रवण भेदभाव कार्य है। लर्निंग और इस शटल बॉक्स जाने / में दीर्घकालिक स्मृति गठन नहीं जाओ-कार्य में वृद्धि हुई cortical डोपामाइन संकेतन और प्रोटीन संश्लेषण के आधार पर तंत्र शामिल है। तदनुसार, gerbils और चूहों पर हाल ही में प्रोटिओमिक पढ़ाई के dopamine- और cortical में synaptic घटकों के सीखने प्रेरित प्लास्टिक rearrangements, लेकिन यह भी अधिक बेसल मस्तिष्क क्षेत्रों माना जाता है कि FMTD सीखने और स्मृति 6-8 दौरान बातचीत में पता चला। यह दिखाता है कि स्मृति गठन मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों की एक जटिल परस्पर क्रिया शामिल है और इस प्रकार, विभिन्न proteome स्तर पर इन क्षेत्रों के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है। इसलिए, चयनित cortical और subcortical माउस मस्तिष्क क्षेत्रों के विच्छेदन कार्यप्रवाह में शामिल है।
इसके अलावा, विश्वसनीय characterizatiयहां तक कि synaptic प्रोटीन संरचना में कमजोर परिवर्तन की बजाय homogenates या कच्चे तेल की झिल्ली अंशों 9 के विश्लेषण के पूर्व और postsynaptic डिब्बों में से एक संवर्धन की आवश्यकता है। इसलिए, synaptosomes की तैयारी की स्थापना का उपयोग प्रोटोकॉल प्रोटिओमिक विश्लेषण करने से पहले आदेश का पता लगाने के स्तर पर और अन्तर्ग्रथन-विशिष्ट प्रोटीन 10,11 के लिए गतिशील रेंज बढ़ाने के लिए वर्णित है।
मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए लेबल मुक्त उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने के लिए एक आवश्यक शर्त प्रोटीन के नमूने की समानता के एक उच्च डिग्री है। जैसा कि synaptic प्रोटीन संरचना में नहीं बल्कि मामूली परिवर्तन सीखने, एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण इसी प्रशिक्षित और भोले चूहों से प्राप्त प्रोटीन के नमूने की तुलना करना उचित होगा के बाद होने की उम्मीद कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, स्थिर आइसोटोप (जैसे टीएमटी, iTRAQ, आईसीपीएल और SILAC) के साथ ही MS2 आधारित लेबल मुक्त योग्यता के रूप में उपयोग करते हुए प्रोटीन / पेप्टाइड्स की हालत-विशिष्ट लेबल रणनीतियोंntification (पट्टी) उपयोगी होते हैं, लेकिन वे चुना लेबल मुक्त दृष्टिकोण की तुलना में अधिक महंगे हैं या विशेष बड़े पैमाने पर spectrometric हार्डवेयर की जरूरत है।
प्रोटिओमिक स्क्रीनिंग अक्सर जटिल डेटा सेट उपज के बाद से, bioinformatic प्रसंस्करण उपयुक्त डेटा व्याख्या के लिए सिफारिश की है। अतिरिक्त मेटा-विश्लेषण संभावित आणविक प्रतिमान से संबंधित परिवर्तन और इसमें शामिल कुंजी सेलुलर प्रक्रियाओं और संकेत रास्ते की पहचान अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ समर्थन कर सकते हैं। उचित तरीके भी नीचे वर्णित हैं।
अध्ययन में सीखने और चूहों के मस्तिष्क विभिन्न क्षेत्रों में स्मृति समेकन के दौरान synaptic प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का एक सटीक मात्रात्मक रूपरेखा के लिए अनुकूलित एक methodological कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है। सेटअप बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण के लिए नमूना प्रति कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृति के लिए आवश्यक आवेदन के बावजूद एक भी पशु के स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन का अवसर प्रदान करता है।
कार्यप्रणाली खाते में पूर्व और postsynapse उच्च आणविक भार पाड़ प्रोटीन से मिलकर की विशेष प्रोटीन संरचना लेता है, लेकिन असर मध्यम या कम आणविक भार महत्वपूर्ण मध्यस्थ प्रोटीन का भी। synaptosomal तैयारियों के बारे में समाधान हज़म एक कुशल पीढ़ी में परिणाम और, इसलिए, पाड़ व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के एक से अधिक प्रतिनिधित्व। यह, बारी में, छोटे या कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का विश्लेषण दबा सकते हैं। एक से एसडीएस पृष्ठ अंशों का सुझाव दिया तैयारीसमानांतर में एक में जेल पाचन प्रक्रिया के साथ संयुक्त प्रत्येक नमूने की विभाज्य मध्यम और कम बहुतायत प्रोटीन का विश्लेषण की सुविधा और एक अत्यधिक की सिफारिश की पूरक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। एक नमूना से निकाली गई सभी भागों का अलग बड़े पैमाने पर spectrometric आवेदन के बाद (जैसे-समाधान को पचाने में जेल पचाने, संयुक्त phospho समृद्ध अंशों) इसी एमएस / एमएस डेटा सेट जोड़ा जा सकता है और आगे प्रोटीन की पहचान और चोटियों से मात्रा का ठहराव के लिए गणना सॉफ्टवेयर या वैकल्पिक लोकप्रिय सॉफ्टवेयर संकुल।
वैकल्पिक रूप से, इन समाधान पचा नमूना के उत्पन्न एक नमूना की जेल में पाचन व्युत्पन्न भिन्न (एक नमूना लेन का अलग से संसाधित जेल क्षेत्रों) और भिन्न के अलग-अलग आवेदन करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा जैसे) में वृद्धि कर सकते हैं विश्लेषणात्मक गहराई। हालांकि, इस विस्तारित कार्यप्रवाह नाटकीय रूप से LS-एमएस / एमएस डाटा अधिग्रहण के लिए आवश्यक समय बढ़ जाती है। generatio के लिएसीखने और स्मृति गठन प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग की एक निर्धारित समय के दौरान synaptic प्रोटीन rearrangements की एक विस्तृत आणविक अनुक्रम के एन आवश्यक है। इस बार कोर्स के बाद या यहां तक कि पहले प्रशिक्षण सत्र के दौरान तुरंत शुरू करने और एक बंद-meshed समय सीमा को शामिल किया गया हो सकता जब तक 'जानवरों के प्रदर्शन के बाद लगभग सीखने की अवस्था के asymptotic के स्तर पर पहुंच गया। 8 – प्रशिक्षण के 10 दिनों (विवरण के लिए चित्र 2 देखें)।
synaptic प्रोटीन के फोस्फोराइलेशन परिवर्तन का विश्लेषण FMTD सीखने के दौरान चयनित समय फ्रेम पर एक विशेष ध्यान की आवश्यकता है। एक हाथ cascades संकेत synaptic प्रोटीन प्रोटीन phosphorylations और dephosphorylations से चालू होने के लिए जाना rearrangements की शुरुआत पर पशु प्रशिक्षण का बहुत ही प्रारंभिक अवस्था में होने की संभावना है। दूसरी ओर, वहाँ कई फॉस्फोरिलेटेड synaptic जाना जाता प्रोटीन के लंबे समय तक चलने संशोधनों जो एस भीतर कनेक्टिविटी और विधानसभा को विनियमित रहे हैंynaptic वास्तुकला 19, 20। उन posttranslational संशोधनों भी स्मृति समेकन के बाद के समय बिंदुओं पर उम्मीद कर रहे हैं।
जटिल इस प्रोटिओमिक कार्यप्रवाह द्वारा उत्पन्न डेटासेट bioinformatic संसाधन की आवश्यकता आणविक मार्ग और चाबी के अणुओं के भाग लेने की पहचान। मेटा-विश्लेषण महत्वपूर्ण overrepresented रास्ते, जो सीखने और स्मृति प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभा चलता।
The authors have nothing to disclose.
We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).
3M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
C57BL/6J mice | Charles River | ||
Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
Formic acid | Fluka | 14265 | |
GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
Gephi | https://gephi.org/ | ||
Glycerol | AppliChem | A1123 | |
Glycine | AppliChem | A1067 | |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
Homogenization vessel 2 mL | Sartorius AG | 854 2252 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
RapiGest | Waters | 186002122 | |
Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
Urea | AppliChem | A1049 | |
Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |