High Resolution Kvantitativ Synaptic Proteome Profilering av mus hjernen regioner Etter auditiv diskriminering Learning

Summary

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Abstract

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.

High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

Introduction

Læring er basert på dannelsen av minne spor og vedlikehold. Det er allment akseptert at en underliggende mekanisme kan representere en aktivitet avhengig dannelsen av nye og / eller omorganisering av eksisterende synaptiske kontakter mellom nerveceller. På molekylært nivå, har ulike protein modifikasjoner, subcellulære relocalizations og endringer i omsetningen av synaptiske proteiner blitt beskrevet ^1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). Men de fleste studiene hittil fokusert på utvalgte proteiner i stedet for på det globale men komplekset synaptisk proteome sammensetning. Den nåværende tilnærmingen gir en upartisk screening for synaptiske proteomet endringer i mus hjernen etter et læringseksperiment. Det er egnet til å gjengi tid punktavhengige molekylære øyeblikksbilder av lærings-indusert omorganisering av den synaptiske arkitektur. Den beskrives arbeidsflyten krever en bestemt teamarbeid av ulike spesialister i dyrs atferd, protein biokjemi, massespektrometri og Biolnformatics.

Den valgte læring paradigme, dvs. frekvens-modulert tone diskriminering (FMTD), er en godt karakterisert auditiv diskriminering oppgave hos gnagere ^5. Læring og langsiktige minne formasjon i denne shuttle boksen Go / No-Go-oppgave innebærer mekanismer avhengig av økt cortical dopamin signalering og proteinsyntesen. Følgelig siste proteomikk studier på ørkenrotte og mus viste dopamine- og lærings-indusert plast rearrangements av synaptiske komponenter i hjernebarken, men også i mer basale hjerneområder som visstnok samhandler under FMTD læring og hukommelse ^6-8. Dette illustrerer at hukommelsen dannelse involverer et komplekst samspill av forskjellige områder av hjernen og således kan bli differensielt regulert innenfor disse områdene på proteome nivå. Derfor er disseksjon av utvalgte kortikale og subkortikale mus hjernen regioner inngår i arbeidsflyten.

Videre er pålitelig characterizatipå selv svake forandringer i synaptiske proteinsammensetning krever en berikelse av pre- og postsynaptisk kamrene i stedet for analyse av homogenater eller rå membranfraksjoner ^9. Derfor er fremstillingen av synaptosomer utnytte etablerte protokoller før proteomikk analyse er beskrevet for å øke deteksjonsnivå, og det dynamiske området for synapse-spesifikke proteiner ^10,11.

En viktig forutsetning for å bruke label-free høyoppløselig massespektrometri for kvantitative formål er en høy grad av likhet i proteinprøver. Som heller mindre endringer i synaptiske proteinsammensetning forventes å oppstå etter å lære, vil en etikett-fri tilnærming være hensiktsmessig å sammenligne tilsvarende proteinprøver hentet fra trente og naive mus. Alternativt, tilstandsspesifikke label strategier for proteiner / peptider ved hjelp av stabile isotoper (f.eks TMT, iTRAQ, ICPL og SILAC) samt MS2-baserte label gratis quantification (SWATH) er nyttige, men de er dyrere enn den valgte etikett fri tilnærming eller trenger spesiell massespektrometrisk maskinvare.

Siden proteomikk screenings ofte gir komplekse datasett, er bioinformatiske behandling anbefales for riktig tolking. Andre meta-analyser kan støtte en bedre forståelse av potensielle molekylære mekanismene bak paradigmet relaterte endringer og identifisering av involverte viktige cellulære prosesser og signalveier. Egnede metoder er også beskrevet nedenfor.

Protocol

Alle prosedyrer inkludert dyr fag ble utført i samsvar med bestemmelsene i den tyske Federal Law, de respektive EU-regelverket og NIH retningslinjer, og har blitt godkjent av etisk komité av Landesverwaltungsamt Sachsen / Anhalt (42502-2-1102 IFN). 1. Auditiv læring Auditiv diskriminering læring i shuttle boksen (FMTD paradigme) Merk: Bruk alltid hansker ved håndtering musene. Hus C57BL6 / J-mus i grupper på tre eller fire med fri tilgang til mat pellets og vann fra springen i klar polykarbonat bur. Opprettholde en 12 timers lys: mørke syklus i dyret anlegget. Hvis dyr er mottatt fra en annen lab eller fra et firma som tillater minst en uke med akklimatisering og slo seg ned i. Utfør en shuttle boks treningsøkt per dag. Ta musen fra sitt hjem bur i dyre anlegget og plassere den i et svakt opplyst shuttle boksen innenfor en lydtette kammer. Bruk en fullstendig datastyrt læring tidsplan for auditiv diskriminering læring. Begynn med en tilvenning periode på 3 min stillhet, og deretter starte treningsøkten. Bruk sekvenser av den stigende tone (4-8 kHz, CS +) som Go-stimulans i løpet Go-studier: Dyret har å krysse hinderet innen 6 sek tone presentasjon (riktig svar, traff). Straffe en glipp av en mild fot-sjokk av 50 – 300 uA, levert via nettet etasje av shuttle-boksen. Bruk sekvenser av den fallende tone (8-4 kHz, CS-) som No-Go-stimulans i løpet av no-go-forsøk: Dyret har til å forbli i den aktuelle avdeling av shuttle boksen under 6 sek tone presentasjon. Straffe en falsk alarm ved en mild fot-sjokk av 50 – 300 uA, levert via nettet etasje av shuttle-boksen. Bruk intertrial intervaller på 20 5 sek. Utfør 30 Go-forsøk og 30 no-go-forsøk per økt i en pseudo-randomisert rekkefølge, slik at man session består av 60 forsøk og varer ca 25 min. Sett trent dyret tilbake i sitt hjem buret i dyre anlegget. Brain disseksjon Avlive dyret på det ønskede tidspunkt etter at et ønsket antall kurs ved hjelp av cervical dislokasjon (for eksempel 24 timer etter fullføringen av den første sesjon). Halshogge dyret. Raskt dissekere hjernen via følgende trinn: Kutt først huden og deretter skallen med rette saks langs sutura sagittalis. Fullstendig å fjerne de deler av benet som dekker hjernevevet ved hjelp av sterke tang. Ta ut hjernen med en spattle. For disseksjon, plasserer hjernen på en petriskål fylt med is. Dissekere auditiv cortex, frontal cortex, striatum og hippocampus under et stereomikroskop ved hjelp av en skalpell og en nål. Lokalisere auditiv cortex ved hjelp av visuelle landemerker på hjernen surface slik som blodkar og formen av overflaten (Bregma -2,06 til -3,4, størrelse rostrocaudal 2 mm, dorsoventral 1,3 mm) og bilateralt dissekere som en rektangulær vev blokk med tykkelse på hjernebarken. Dissekere frontal cortex som en hjerne skive mellom Bregma 3,56 og 1,54 hjelp av chiasma opticum som et landemerke og uten vev fra bulbus olfactorius. Dissekere striatum som en hjerne skive mellom Bregma 1,54 og 0,5 og fjerne kortikale vev nøye. Dissekere hippocampus ved å feste hjernen med nålen gjennom lillehjernen og uncoiling cortex starter på bakhodelapp. Shock-freeze dissekert hjerneprøver i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. 2. Utarbeidelse av synaptosomer eller alternativt en postsynaptiske-density (PSD) anriket Fraksjon MERK: Under alle prosedyrer, holde prøver og buffere ved 0-4 ° C.Buffere inneholder friskt fortynnet protease inhibitor cocktail for å forhindre proteolytisk degradering av proteiner. Hvis proteinfosforylering er studert, fosfatase inhibitor cocktails må legges til. Alle g-verdier som er angitt er kun gitt som g (gjennomsnitt) gjennom hele protokollen. Fremstilling av en uren membranfraksjon (figur 3A) Transfer dissekert hjernevev til en homogenisering beholder som inneholder en ml iskald buffer A (5 mM HEPES, 320 mM sukrose, pH 7,4) og homogenisere vev ved 900 rpm med 12 slag. Sentrifuger prøvene ved 1000 xg i 10 min. Hold supernatantene. Re-homogen pellets ved de samme betingelser i samme volum av homogeniseringsbuffer som før og sentrifugere prøven igjen ved 1000 xg i 10 min. Kombiner tilsvarende supernatanter. Kast pellets P1, som i hovedsak inneholder kjerner og cellerester. Spinn kombinerte supernatanter i 20 minutter ved 12 000 x g. Forkast supernabyggere eller bruk for videre fraksjone 11. Resuspender pellet i det samme volum av homogeniseringsbuffer som før ved hjelp av homogenisatoren med 6 slag ved 900 opm og sentrifugering ved 12 000 xg i 20 min. Kast supernatants. Pellets P2 representerer rå membran fraksjoner. Rensing av synaptosomer fra rå hjernemembranfraksjoner (figur 3A) MERK: Rå hjernemembranfraksjoner kan deles inn i myelin, lette membraner, synaptosomer og mitokondrier ved hjelp av sukrose tetthet trinn-gradient-ultrasentrifugering. For dette 5 mM Tris / HCl pH 8,1 buffer inneholdende sukrose på enten 0,32 M, 1,0 M og 1,2 M konsentrasjon er nødvendig. Mens du utfører sentrifugering for å produsere P2 fraksjoner, forberede sukrose trinn gradienter i ultrasentrifuge rør. Starte med 2,5 ml 1,0 M sukrose-buffer og undersjikt med 1,5 ml 1,2 M sukrose-buffer ved anvendelse av en glass Pasteur pipette. Re-homogen P2 fraksjoneri 0,5 ml 0,32 M sukrose buffer manuelt med 6 slag og belastning på toppen av gradient. Spin på xg 85 000 for to timer i en ultrasentrifuge ved hjelp av en svingende bøtte rotor. Kast den øverste 0,32 M sukrose lag inkludert det materiale ved grenseflaten til 1,0 M sukrose-buffer (myelin, lette membraner). Samle synaptosomer på 1,0 / 1,2 M sukrose buffer grensesnitt. Pellet i bunnen av røret inneholder mitokondrier. Legg 0,32 M sukrose-buffer til den synaptosomal fraksjon ved forholdet 1: 1, bland forsiktig og sentrifugering ved 150.000 x g i 1 time. Synaptosomer er i pelleten, og kan nå bli resuspendert i en buffer som kreves for ytterligere bearbeidelse. Fremstilling av en PSD-anrikede fraksjon (figur 3B) Homogenisere hvert enkelt hjerne område fra et enkelt dyr i 100 ul ekstraksjon buffer (5 mM Tris / HCl pH 8,1, 0,5% Triton X-100) i en 200 mL ultrasentrifugerør med et PTFE (polytetrafluoretylen) støterved 2000 rpm med 12 slag. Tilsett 100 ul ekstraksjonsbuffer, blandes og inkuberes i 1 time ved 4 ° C. Spinn ned på 100 000 xg i 1 time og samle supernatanten S1 forsiktig med en 200 mL pipette. Re-homogen pellet P1 i det samme rør med 100 pl buffer ekstraksjon på nytt med en PTFE pistill ved 2000 rpm med 12 slag. Tilsett 100 mL utvinning buffer og bland godt med en pipette og spinn på 100 000 xg i 1 time. Kombiner supernatanten S2 med S1 til den løselige proteinfraksjon. Denne fraksjonen inneholder cytosoliske proteiner, 0,5% Triton X-100 oppløselig membranproteiner og ekstracellulære matriks-molekyler. Resuspender den gjenværende pellet i 50 pl 5 mM Tris / HCl pH 8,1. Denne fraksjonen inneholder PSD, vaskemiddel bestandig membraner, uløselige cytoskeletal elementer, mitokondrier og celleavfall inkludert kjerner. Det er anriket på PSD som danner kjernen i postsynaptiske konstruksjoner, men også viktige deler av den presynaptiskecytomatrix ved den aktive sonen. Faktoren for anriking av PSD er rundt fire og berikelse av PSD komponenter er vist tidligere. 12 3. Prøvepreparering for massespektrometri Lysis og prøve normalisering MERK: Prøve normalisering om proteinkonsentrasjonen er et svært viktig skritt for å endelig oppnå pålitelige kvantitative data selv for svake synaptiske protein expression endringer. Løs opp synaptosomer eller PSD-beriket forberedelser av hvert hjerneområde av et dyr i 20 – 50 mL (avhengig av total mengde materiale: for auditive cortex med 5-15 mg vev bruk 20 ul) av 8 M urea og inkuber på is i ett hr i et ultralydbad. For i-gel fordøye, oppløse synaptosomer direkte i SDS-prøvebuffer. Nøye beregne den lastede mengde for å unngå overbelastning av gelen. Tenker på at i dette tilfellet, den høye rikelig stillaset Proteinkonns vil gå tapt i løpet av gelelektroforese og i-gel fordøye. Fortynn med 1% av en fjernbar vaskemiddel for å sikre en endelig konsentrasjon på 2 M urea. Unngå enhver temperatur som er høyere enn 30 ° C for å forhindre proteinet karbamylering. Utføre SDS-PAGE med en alikvot (for eksempel 10 pl) av prøven i henhold til standardprosedyrer 13,14. Flekk gelen med Coomassie blå ifølge produsentens protokoll. Fremgangsmåten kombinerer feste og fargingstrinnet med metanol og eddiksyre. Bestem den optiske tettheten til hver prøve for hele kjørefelt med en kalibrert gel scanner i transmisjonsmodus og beregne den relative proteinmengden. Normalisere prøvene i henhold til disse beregningene. Splitte hver prøve i to ulike deler. Bruk en tredjedel for i-gel fordøye og to tredeler for in-løsning fordøye. In-gel fordøye <strong> Gel separasjon Utføre en andre SDS-PAGE anvendelse konsentrasjonsjustert prøver. Flekk og kvantifisere gels for andre gang for å sjekke normalisering kvalitet. Skjær ut hver kolonne av en prøve inne i gelen i forskjellige områder (8 / felt), men utelukker molekylvektområdet over 170 kDa. Overfør Gelstykkene i separate rør. Skjær de områdene i mindre biter (ca. 1 x 1 mm) med en skarp skalpell til rette i-gel fordøyelse effekt. Digest 15 Vask gelbitene flere ganger (avhengig av fargeintensitet) i 10 minutter med 50 – 150 ul av en buffer bestående av 50% acetonitril (ACN) og 50 mM ammonium-hydrogenkarbonat (NH 4 HCO 3). Fjern supernatanter. Dekk gelbitene med ACN og inkuber ved 20 ° C inntil gelbitene blir hvite og krympe. Fjern ACN og rehydrere Gelstykkene for 5min med 50 ul 0,1 M NH HCO 4 3. Tilsett det samme volum ACN og inkuberes i ytterligere 15 minutter ved 37 ° C. Fjern og kast væske helt. Tørk de gelstykkene i en vakuumsentrifuge. Rehydrere gelstykkene i 50 ul NH 4 HCO 3 inneholdende 10 mM ditiotreitol (DTT) og varme prøvene i 45 minutter ved 56 ° C for å redusere cysteinrester. Fjern supernatanten og tilsett 50 mL NH 4 HCO 3 inneholder 55 mM iodoacetamide (IAA) i 30 min i mørket for å carbamidomethylate reduserte cysteiner. Fjern og kast all væske over gel stykker og vask dem to ganger med 50 mL NH 4 HCO 3 og ACN (1: 1) i 10 minutter for å fjerne eventuelle gjenværende IAA. Tørre prøver i en vakuumsentrifuge. For begrenset fordøyelse av proteiner legge 25 mM NH 4 HCO 3 inneholder 12,5 ng / ul trypsin. Det nødvendige volum er avhengig av størrelse og mengde av gelen pieces. Inkuber i noen minutter og sjekk om bufferen er absorbert. Tilsett mer buffer hvis nødvendig, gel brikkene skal være helt dekket. Inkuber ved 37 ° C over natten (min. 12 timer). Peptide utvinning Overlegg gel stykker med 10 – 20 mL 25 mM NH 4 HCO 3 og legge til samme volum av ACN. Inkuber i 10 minutter på is ved hjelp av ultralyd-bad. Etterpå fjerne og samle supernatanter som inneholder de fleste av de genererte peptider. Tilsett 100 ul av ekstraksjonsbuffer inneholdende 30% ACN / 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) til gelen stykker. Gjenta inkubasjon i et ultralydbad og nøye samle denne supernatant. Gjenta de siste utvinning trinn ved å øke ACN konsentrasjonen til 50%. Etter 10 min av ultralydbad spinne ned og samle supernatantene. Kombiner alle de tre tilsvarende supernatanter av ekstraksjonstrinn og tørke dem i en vakuumsentrifuge. Noter detsom et resultat av gelen separasjons de 8 områdene per kjørefelt / prøve kombineres til en prøve på nytt i dette trinnet. In-oppløsning fordøye Fordøye Bruke den beregnede mengde (for eksempel 100 ul av en 150 ul lysat, avhenger av mengden av materiale og det volum som er nødvendig for resuspendering av en prøve fra et bestemt hjerne område) av normaliserte prøver for å oppnå tilstrekkelig utgangsmateriale i minst tre tekniske replikater til utføre label-free massespektrometri. Tilsett 2 mM DTT i 25 mM NH 4 HCO 3 og forsiktig vortex prøven. Redusere prøvene i 45 minutter ved 20 ° C. Legg 10 mM IAA til carbamidomethylate cysteinrestene. Bland og inkuber i 30 minutter i mørke ved 20 ° C. Til slutt, tilsett 1 pl av en trypsin-stamløsning (1 ug / ul trypsin i 25 mM eddiksyre) og inkuber ved 20 ° C i 12 timer. Solid-fase ekstraksjon (SPE) -Purification For å fjerne den sure spaltbare vaskemiddel, juster prøvene til en sluttkonsentrasjon på 1% TFA og inkuberes i 1 time ved 20 ° C. Sentrifuger prøver ved 16 000 xg i 10 min og nøye samle supernatantene. Plasser SPE-kolonne i et stativ og likevekt grunnmassen med 2 ml metanol. Vask to ganger med 2 ml 0,1% TFA i vann (buffer B). Tilsett 2 ml buffer B og laste prøven. Vask ytterligere tre ganger. Eluere peptidene ved tilsetning av 200 ul 70% ACN / 0,1% TFA. Gjenta dette trinnet. Pool både eluater og tørk dem ned i en vakuumsentrifuge. Fosfor-peptid-berikelse av TiO 2 kromatografi 16 Oppløs peptider produsert ved in-gel eller in-oppløsning digest i 150 ul 80% ACN / 2,5% TFA (buffer C) og likevekt ~ 2 mg av TiO 2-perler i 50ul buffer C. Legg perler til prøven og inkuber i en roterende anordning i 1 time ved 20 ° C. Etterpå perler spin ned (16.000 xg, 1 min) og samle supernatantene. Vask kulene tre ganger med 100 ul buffer C ved forsiktig å blande og å spinne ned etter 5 min. Samle supernatants. Gjenta dette trinnet tre ganger med 100 ul 80% ACN / 0,1% TFA, etterfulgt av tre vaskinger med 100 ul 0,1% TFA (uten ACN), henholdsvis. Kombiner alle ti supernatanter, tørk dem i et vakuum sentrifuge og håndtere dem som fosfor-peptid-utarmet brøkdel for ytterligere rensing ifølge trinn 3.5. Eluere de bundne fosfo-peptider med 20 pl 400 mM NH4OH / 30% ACN fra kulene. Gjenta dette trinnet tre ganger og samle alle supernatanter etter spinne ned perlene. Kombiner eluatene av in-gel fordøye og av in-oppløsning digest av en prøve, og håndtere dem som fosfo-peptide-anrikede fraksjon. Tørke dem i en vakuumsentrifuge til et sluttvolum på 4 – 8 pl. Konsentrerer og avsalting av fosfor-peptid-utarmet fraksjoner av mikro-SPE Oppløs de tørkede peptider i 20 ul 0,1% TFA. Stabilisere den faste C 18 -matrix ved å tegne 20 mL ACN i spissen. Vask matrisen ved å trekke 0,1% TFA i vann inn i tuppen. Gjenta prosessen tre ganger. Sakte laste forsurede prøven i spissen (gjenta dette trinnet tre ganger). Vask C 18 -matrix tre ganger med 20 ul 0,1% TFA i vann og kast vaskeløsningen. Eluere peptider fra pipettespissen ved gjentatte ganger (3 ganger) drawing 20 ul 70% ACN / 0,1% TFA og samle denne eluering oppløsning i et separat rør. Kombiner eluatene i en prøve og tørke dem i en vakuumsentrifuge. 4. Proteome Analysis <p> MERK: Proteome Analysen er utført på en hybrid dual-press lineær ionefelle / orbitrap massespektrometer utstyrt med en ultra HPLC. HPLC er sammensatt av en avkjølt autosampler med en 20 ul injeksjonssløyfe, en binær lastepumpe (pl flytområde), en binær nano strømningsdeling pumpe, en kolonne ovn med to mikrobryterventiler og en gassutskiller. Prøvene blir først underkastet en felle kolonne (for eksempel 100 mikrometer x 2 cm) ved en strømningshastighet på 7 mL / min, etterfulgt av separering på en kolonne (for eksempel 75 um x 25 cm) ved 250 nl / min. Separasjonskolonnen utløp er direkte koplet til et belagt Pico emitter spiss posisjonert i en nano-spray interface ved massespektrometer ioniseringskilden. Nano-væskekromatografi og tandem massespektrometri Oppløs peptid prøver i 12 ul 2% ACN / 0,1% TFA i minst 30 min. Spinn ned i 15 sek og overføre 11 mL supernatant til autosampler hetteglass (konisk, redusert diameter). Sett opp en automatisert regime for prøveprogrammet, kromatografisk separasjon og tandem massespektrometri på å kontrollere programvare (f.eks Xcalibur) som følger. Bruk følgende for Temperatur: Autosampler: 5 ° C; Kolonne ovn: 45 ° C. Bruk følgende for injeksjon: Volum: 10 ul; Strømningshastighet: 7 mL / min (2% ACN, 0,1% TFA); Tid: 8 min; Innstillingen Valve: felle kolonne – avfall; masse spec oppkjøpet: off. Bruk følgende for Separation: Strømningshastighet: 250 nl / min Valve innstilling: trap kolonne-separasjon kolonne; masse spec oppkjøpet: på. 0 min – 100 min: 2% ACN, 0,1% maursyre – 40% ACN, 0,1% maursyre 100 min – 105 min: 40% ACN, 0,1% maursyre – 95% ACN, 0,1% maursyre 105 min – 109 min: 95% ACN, 0,1% maursyre 109 min – 120 min: 2% ACN, 0,1% maursyre Bruk følgende for massespektrometri innstillinger: Full MS: FTMS; oppløsning 60000; m / z range 400 – 2000; MS /MS: Lineær Iontrap; minimum signal terskel 500; isolasjon bredde 2 Da; dynamisk utelukkelse tidsinnstilling 30 sekunder; enkeltvis ladde ioner er utelukket fra valg; normalisert kollisjonsenergi er satt til 35%, og aktiveringstiden til 10 ms. MERK: En full MS scan er etterfulgt av opptil 15 LTQ MS / MS kjører ved hjelp av kollisjons-indusert-dissosiasjon (CID) av de mest rikelig oppdaget peptid ioner. Kjør tre tekniske replikater for alle prøvene. Protein identifikasjon og etikett gratis kvantifisering Prosess massespektrometri rådata mot protein identifisering og etiketten fritt kvantifisering benytte en kommersiell programvarepakke (f.eks, topper Studio). I motsetning til de fleste andre proteom- programvarepakker bruker denne programvaren en de novo -sequencing algoritme før protein database justeringer. Imidlertid kan dette trinnet være lett erstattes av andre populære programvarepakker. bruk essential innstillingene som er oppført i tabell 2. Phospho-proteomikk MERK: Effektiv og pålitelig fosfor-peptid oppkjøp krever noen vesentlige endringer av proteomikk arbeidsflyten oppsett. Etter fosfor-peptid berikelse, aldri tørre prøver helt. Hold alltid prøver oppløst. MERK: fosfor-esterbindingen av fosforylerte treoniner eller seriner er svært skjør. Under kollisjonen-indusert fragmentering innenfor ionefelle dette resulterer i en nøytral tap av fosfat. Dette hindrer ytterligere fragmentering av peptidet, som i sin tur er nødvendig for identifikasjon. Tillatt bredbånds-aktivering i massespektrometri oppsett gir fragmentering av fosfo-peptider, selv etter en nøytral tap av fosfatgruppen. Den utfører en tidsbesparende "pseudo-MS 3". Phospho stedet bestemmelse i MS / MS data krever en spesiell kontroll og evaluering og kan utføres av fosfor 3.0. 5. Bioinformatikk – Meta-Analysis MERK: Før du utfører funksjonell annotering og nettverksanalyse, protein listene må preprocessed. Først slå sammen lister over regulerte proteiner og fosfo-peptider for hver hjernen regionen separat. Deretter fjerner all kopiere Uniprot-IDer for hver fraksjon for å unngå feiltolkninger. Singular berikelse analyse med GeneCodis 17 Åpne web-basert verktøy for GeneCodis (http://genecodis.cnb.csic.es) Velg "Mus musculus" som organismen og "GO biologisk prosess" som merknad. Lim inn en liste over Uniprot-IDer av en viss brøk. Send inn og vente til analysen er utført. Klikk på "Singular Enrichment Analyse av GO biologisk prosess" og vise resultater. Gjenta trinn 5.1.3 for de tre andre fraksjoner. Å se noen duplikasjoner og strekningene mellom resultatlisterbruke et skriptspråk som Perl eller Python til å filtrere dataene som trengs. Lignende verktøy for en enestående berikelse analyse er DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) og Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) med PlugIns BINGO (http://apps.cytoscape.org/ apps / bingo) og ClueGO (http://apps.cytoscape.org/apps/cluego). Generere en kraft basert graf ut av GeneCodis data med Gephi (https://gephi.org/) MERK: All data for de grafene skal gis av brukeren, enten i en graf format (.gexf, .graphml, DOT, .gv, .gml) eller kom inn for hånd. Generering grafen noder For hånd: Open Gephi og klikk på "Data Laboratory". Opprett noder. Klikk på "noder" til venstre for å bytte til "noder" tabellen. Klikk på "Legg til node". Skriv inn navnet på Term. Klikk på "OK" / Trykk på Enter. Alternative Spar GeneCodis føre til PC. Åpne .txt med et regnearkprogram. Slett alle rader except fra "Item_Details" (term navn). Endre header "Item_Details" til "Label". Lagre regneark som "CSV". Nå i Gephi, klikk på "Importer regneark". Velg regneark fra filbehandleren av Gephi. Klikk "Next". Klikk "Finish". Koble noder via kantene. Klikk på "Edges" til venstre for å bytte til "Edges" tabellen. For hver node (Term): se opp genet navn i andre vilkårene. Hvis ett eller flere gener som er delt -> lage kant. Klikk på "Legg Edge". Velg "urettet". Velg kilde og mål node ut av nedtrekksmenyene. Klikk på "OK" / Trykk på Enter. Hvis mer enn ett gen er delt, skriv overflod i "vekt" (tabell). Force basert grafisk layout. Åpne graf datafil, sette graftypen til «urettet" eller bruke dataene som kom inn for hånd, klikk på "Oversikt" hvis det ikke allerede i valgted. Resize noder avhengig av overflod av samtrafikk. Klikk på statistikk, kjøre enten "Average Degree" (uvektet kanter) eller «Nr. Vektet Degree" (vektet kanter) under "Network Oversikt". I "Utseende", klikk på "noder", deretter på Størrelse-knappen, neste velg "egenskaper" og angi attributter parameteren til "Nr. Vektet grad" eller "Average Degree". Klikk på Bruk. Til slutt: Velg "Force Atlas" i "Oppsett" og kjøre; endre "Repulsion styrke" hvis noder er å kollidere. Eksporter til bilde. Skjermbilde egenskap: Klikk på "Oversikt", endre grafen layout, kanttykkelse, etikettstørrelse og skalering med menyen nederst i "Graf" -vinduet. Klikk på kamera venstre knappen, og lagre bildet. Eksport funksjonen i "Preview": Klikk "Preview". Endre Presets til "Standard straight". Endre innstillings ifølge de valgte innstillingene og klikk på "SVG / PDF / PNG" for å eksportere.

Representative Results

Figur 1 oppsummerer hele arbeidsflyten av kvantitative synaptiske proteomet profilering av mus hjernen etter auditiv diskriminering læring. Det starter med dyret opplæring i en shuttle boks. I eksempelet vist i figur 2, musene begynte å vise betydelig FM tone diskriminering i 4. treningsøkten, hvilket indikerer effektiv læring. Dyr blir ofret på utvalgte tidspunkter for hjerneområde disseksjon. Den nødvendige anrikning av synapser kan enten oppnås ved fremstillingen av synaptosomer eller alternativt ved fremstilling av en PSD-anriket fraksjon, som begge er beskrevet i detalj i figur 3. Den PSD-anrikning metode er blitt utviklet for lave mengder vev, for eksempel 1 – 2 hippocampus skiver fra rottehjerne 12, 18. Det krever små rør, PTFE pestles montering til disse rørene, og et laboratorium bore kjøretur for å drive stampe. På grunn av den spesielle proteinsammensetningen av synaptosomer, er det sterkt anbefalt å utføre prøveopparbeidelse i to forskjellige, men utfyllende måter. Stillaser av PSD er ofte meget høy molekylvekt proteiner som forekommer i høy støkiometri. In-oppløsning sammendrag er den beste måten å pakke dem effektivt, men kan føre til en oversampling av den genererte peptidblandingen. Den in-gel fordøye utføres av den samme prøven i parallell kan utelukke disse proteinene av høymolekylvekt og favorisere analyse av proteiner med middels og lavere molekylvekt. For en omfattende analyse begge typer proteolytiske fordøyer anbefales. De forskjellige mengder av vev i hjernen områder er undersøkt kreve en justering av det påførte materiale for bedre sammenligning. Innenfor de fire undersøkte hjerneområder auditiv cortex er vanligvis den begrensende faktumeller. Materialet av alle andre hjerneområder bør nøye justeres i forhold til mengden av det auditive cortex etter fremstilling av synaptosomer eller PSD-anrikede fraksjoner (se 3.1.1.). Typiske vekter av nylagde hjernen områder fra mus er som følgende: auditiv cortex (AC): ~ 50 mg; hippocampus (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg og frontal cortex (FC): ~ 100 mg. PSD-anrikning fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 2.3 tillot identifikasjon av ca 1500 forskjellige proteiner og omtrent 250 forskjellige fosfo-peptider pr hjerneregionen på nivå av ett enkelt dyr (tabell 1). Proteomikk analyse 24 timer etter den første treningsøkten viste at 7,3% av de identifiserte proteiner og 5,8% av fosfo-peptidene viste signifikant (p <0,05) kvantitative forandringer i deres synaptiske ekspresjon sammenlignet med ubehandlede kontroller (tabell 1). Et påfallende tendens til ned regulasjon av synaptiske stillasene kan peke til en uttalt omorganisering av den synaptiske arkitektur i tidlige stadier av FMTD læring. De aller fleste av de regulerte proteiner ble endret i en hjerne regionspesifikk måte, mens bare 22% ble funnet å være regulert i to eller flere hjerneområder. Seks utvalgte eksempler er vist i figur 4. Meta-analyse av komplekse resultatene etter IPA gir bevis for den aktuelle deltakelse / manipulering av følgende kanoniske pathways: "clathrin endocytose signale", "aksonal Guidance Signa", "Kalsium signale", "RhoA Signa", "Notch signale "," Remodeling av epithelial Adherens Junctions "," Glutamate reseptorsignalisering "," GABA-reseptorsignalisering "," Dopamine Receptor signale~~POS=TRUNC "og" Synaptic langtidspotensiering ". <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Enkelt berikelse analyse viste signifikante overrepresentert biologiske prosesser i frontal cortex om protein transport, celle adhesjon, fosforylering, endocytose, vesikkel-mediert transport, brain utvikling og axonogenesis (figur 5). I de auditive cortex biologiske prosesser, inkludert ion transport, oversettelse, mRNA transport, protein transport og læring var merkbar. Analysen av proteinfraksjonen av hippocampus detekterer vesentlig anriket prosesser knyttet til ionetransport, cellesyklus, oversettelse, fosforylering og nervesystemet utvikling. I striatum, overrepresentasjon av biologiske prosesser, inkludert mRNA-transport, vesikkel-mediert transport, axonogenesis, proteolyse, protein transport og endocytose ble funnet. Figur 1: Systematisk Workflow av metodisk tilnærming. Dette tallet oppsummerer skjematisk arbeidsflyten med høy oppløsning kvantitativ profilering av hjerneområdet spesifikk synaptisk proteinsammensetningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: Eksempel på ytelsen til Mus i FM Tone Diskriminering Task. Dyr viser en økende rente treff (blå kurve) og en avtagende rate av falske alarmer (svart kurve) i løpet av treningsøktene. Betydelig diskriminering oppstår fra fjerde sesjon. Feilfelt er gitt som SEM. Klikk her for å se et LARger versjon av denne figuren. Figur 3: Fremstilling av synaptosom og PSD-anrikede fraksjon. A: synaptosompreparat. B: PSD-anrikede fraksjon forberedelse. Begge tallene forklare detaljert arbeidsflyten for utarbeidelse av synaptosomer eller alternativt PSD-beriket fraksjoner fra hjernen vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: Valgt Kvantitativ proteomikk resultater. De relative synaptiske Forekomsten av utvalgte proteiner sammenlignes mellom mus trastilt på FMTD oppgave (AV, n = 6) og naive kontroll mus (NV, n = 6) 24 timer etter første treningsøkt. De overflod verdier ble beregnet som medianen av topparealene for de tre mest intense peptider av et protein. Proteiner med betydelige overflod endringer (AV / NV, t-test) er merket innenfor tomter: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,005. Feilfelt leveres som SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5: Visualisering av biologiske mekanismer for Frontal Cortex av GeneCodis / Gephi. Kun vesentlige vilkårene i databasen Gene ontologi (GO) (http://geneontology.org) relatert til "Biologisk prosess" med et minimum protein nummer tre Her vises. Noder representerer GO betingelser, størrelsen på noden, linjebredde og antall forbindelser i en bestemt node avbilder antall proteiner, som deler denne GO sikt med andre noder. På grunn av "Force Atlas" metode for Gephi er relaterte noder clustering tett sammen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Brain region AC FC HOFTE 000 "face =" Calibri "size =" 3 "> STR Σ identifiserte proteiner 1435 1758 1572 1507 6272 regulerte proteiner (p <0.05) 59 130 162 108 face = "Calibri" size = "3"> 459 ↑ AV / NV 8 4 76 35 123 ↓ AV / NV 51 126 86 73 336 identifisert phosphomoti fs 197 361 273 278 1109 regulerte phosphomotifs (p <0,05) 8 22 21 14 65 ↑ AV / NV 4 00000 "face =" Calibri "size =" 3 "> 17 5 9 35 ↓ AV / NV 4 5 16 5 30 Tabell 1: Oppsummering av en proteomikk Resultat. Denne tabellen oppsummerer en representant proteomikk eksperiment trente mus (AV, n = 6) 24 timer etter første treningsøkt i forhold til sine naive kontroller (NV, n = 6). Desum av 459 regulerte proteiner inneholder overlappende bestemmelser. 283 ulike regelverk ble bestemt som hjernen bestemt. I detalj, er 57 proteiner regulert i to områder av hjernen, ble 18 protein forskrifter påvist i tre områder av hjernen og bare to proteiner er regulert i alle de fire undersøkte hjerneområder. feil~~POS=TRUNC forløper masse (Fourier transformasjon massespektrometri) 10 ppm fragment ion masse (lineær ionefelle) 0.6 Da Maksimalt antall tapte splittelsene per peptid 3 faste modifikasjoner for i-gel-fordøyd prøver Carbamidomethylation av Cysteine for in-oppløsning-spaltet prøvene Methylthiolation av Cysteine variable modifikasjoner Oksidasjon av metionin Deamidations av Asparagin og / eller Glutamin database Uniprot / Sprot taksonomi mus Statistiske identifikasjon-akseptinnstillinger de novo gjennomsnittlig lokale tillit (ALC) > 50% Peptide-falske funnrate (FDR, basert på est. Lokkefugl-fusion) <1% Protein betydning (-10logP, basert på modifiserte T-test) > 20 unike peptider / proteiner ≥ 1 Kvantifisering innstillinger: Peptider som brukes for kvantifisering hvis: Peptide betydning (-10logP) > 30 Peptide identifikasjon i ≥ 50% av prøvene Peptide signalkvalitet > 1 Peptide gjennomsnittlig areal > 1E5 Peptide oppholdstid toleranse <5 4.2.2).

Discussion

Studien presenterer en metodisk arbeidsflyt optimalisert for en nøyaktig kvantitativ profilering av synaptiske protein expression endringer i læring og hukommelse konsolidering i ulike områder av hjernen til mus. Oppsettet gir anledning til å studere protein uttrykk på nivå med et enkelt dyr til tross for det aktuelle programmet på minst tre tekniske replikater per prøve for massespektrometrisk analyse.

Metodikken som tar hensyn til den spesielle proteinsammensetningen av pre- og postsynapse som består av høy molekylvekt stilla proteiner, men også av viktige mediator proteiner som bærer mellom eller lavere molekylvekter. In-oppløsning oppsummeringer av synaptosomale preparater resultere i en effektiv generasjon og dermed en overrepresentasjon av stillas-avledede peptider. Dette, i sin tur, kan undertrykke analyse av mindre eller lavere tallrike proteiner. Den foreslåtte utarbeidelse av SDS-PAGE-fraksjoner fra enaliquot av hver prøve kombinert med en in-gel fremgangsmåte fordøyelse i parallell forenkler analysen av middels og lav overflod proteiner og representerer et sterkt anbefalt komplementær metode. Etter å ha separate massespektrometrisk anvendelse av alle fraksjoner avledet fra en prøve (for eksempel i-løsning fordøye, i-gel fordøye, kombinerte fosfo-anrikede fraksjoner) de tilsvarende MS / MS-datasettene kan kombineres og videre beregnet for protein identifisering og kvantifisering ved topper programvare eller alternative populære programvarepakker.

Alternativt kan den enkelte anvendelse av in-gel-fordøyelse-avledede fraksjoner av en prøve (separat behandlede gel-områder av en prøve kjørefelt) og fraksjoner som genereres av den i-oppløsning spaltet prøve (for eksempel ved ionebytte-kromatografi) for å massespektrometri kan øke analytisk dybde. Men denne utvidede arbeidsflyten øker dramatisk den nødvendige tid for LS-MS / MS datainnsamling. for genen av en detaljert molekylær sekvens av synaptiske protein rearrangementer i løpet av læring og hukommelse i formasjonen en bestemt tid løpet av proteomikk profilering er nødvendig. Denne gangen kurset kan starte umiddelbart etter eller selv under den første treningsøkten og dekker en tett-masket tidsramme til dyrenes prestasjoner nådd asymptotisk nivå av læringskurve etter ca. 8 – 10 dager med trening (se figur 2 for detaljer).

Analysen av fosforylering endringer av synaptiske proteiner krever et særlig fokus på de valgte tidsrammer under FMTD læring. På den ene siden signalkaskader initiere synaptiske protein rearrangements kjent for å være utløst av protein phosphorylations og dephosphorylations forventes på svært tidlige stadier av dyr trening. På den annen side er det langvarige endringer av flere fosforylerte synaptiske proteiner kjent som regulerer tilkobling og montering innenfor synaptic arkitektur ^{19, 20.} Disse posttranslational modifikasjoner er ventet selv på senere tidspunkter minne konsolidering.

De komplekse datasett som genereres av denne proteomikk arbeidsflyten krever bioinformatiske behandling for å identifisere delta molekylære stier og viktige molekyler. Meta-analysen viser betydelige overrepresentert trasé, som spiller en rolle i læring og hukommelse prosesser.

Materials

3M Empore Solid Phase Extraction- Filter	3M Bioanalytical Technologies	4245SD	7 mm/3 ml
Acclaim PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164564	100 µm x 2 cm, C18
Acclaim PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164569	75 µm x 25 cm, C18
Acetic acid	Carl Roth GmbH	3738.1
Acetonitrile (ACN)	Carl Roth GmbH	AE70.2
Acrylamide (30%)	AppliChem	A0951
Ammonium hydrogen carbonate	Fluka	9830
Ammonium hydroxide	Fluka	44273
Ammonium persulfate  (APS)	AppliChem	A2941
Biofuge pico	Heraeus GmbH	75003280
Blue R-250	SERVA Electrophoresis GmbH	17525
Bromophenol Blue	Pharmacia Biotech	17132901
C57BL/6J mice	Charles River
Cantharidin	Carl Roth GmbH	3322.1
Centrifuge tubes for MLS-50	Beckman Coulter	344057
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor	Beckman Coulter	343776
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A1101
Eppendorf 5417R centrifuge	VWR	22636138
Eppendorf A-8-11 rotor	VWR	5407000317
Formic acid	Fluka	14265
GeneCodis	http://genecodis.cnb.csic.es/
Gephi	https://gephi.org/
Glycerol	AppliChem	A1123
Glycine	AppliChem	A1067
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail	Pierce /Thermo Scientific	78420
HEPES Buffer solution	PAA Laboratories GmbH	S11-001
Homogenization vessel 2 mL	Sartorius AG	854 2252
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
Laboratory drilling drive  K-ControlTLC 4957	Kaltenbach & Vogt GmbH	182997
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2	Thermo Scientific
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Scientific
Macs-mix tube rotator	Miltenyi Biotech	130-090-753
Magic Scan 4.71	UMAX
Methanol	Carl Roth GmbH	AE71.2
MLS-50 rotor	Beckman Coulter	367280
Optima MAX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	364300
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PEAKS 7.5	Bioinformatic Solutions
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma-Aldrich	P0044
PhosphoRS 3.1	IMP/IMBA/GMI
PhosSTOP	Roche	4906845001
Plunger/pestle made of PTFE	Sartorius AG	854 2651
PotterS homogenizer	Sartorius AG	853 3024
Protease Inhibitor complete mini	Roche	4693159001
Quantity One 4.5.1	BioRad
RapiGest	Waters	186002122
Shuttle box	Coulbourne Instruments
Sodium dodecylsulfate (SDS)	AppliChem	A1112
Sodium molybdate	Carl Roth GmbH	274.2
Sodium tartrate dihydrate	Sigma-Aldrich	228729
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG	305
Soundproof chamber	Industrial Acoustics Company
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Thermomixer basic	CallMedia	111000
Titansphere TiO 5µm	GL Sciences Inc. Japan	502075000
TLA 100.1 rotor	Beckman Coulter	343840
Trifluoro acetic acid  (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)	AppliChem	A1086
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Trypsin Gold	Promega	V5280
Ultimate 3000 Ultra HPLC	Dionex/Thermo Scientific
Ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	343776
Unijet II Refrigerated Aspirator	Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge	Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
Urea	AppliChem	A1049
Water (high quality purifed)			Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C  Pyrogens: < 0.02 EU/ml                TOC: < 10 ppb
Xcalibur 3.0.63	Thermo Scientific
ZipTipC18 Pipette Tips	MILLIPORE	ZTC18S960