다제내성(MDR) 박테리아 균주에 의한 감염은 공중 보건에 대한 심각한 위협으로 부상하여 대체 치료제의 개발을 필요로 하고 있습니다. 생물발광 영상을 사용하여 마우스 화상에서 MDR Acinetobacter baumannii 감염에 대한 항균 블루라이트(aBL) 요법의 효과를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
다제 내성 항 감염 블루 라이트 치료의 생체 조사에서 아시네 토 박터 바우 마니는 생물 발광 영상을 사용하여 감염을 굽기
이 논문에서
요약
초록
감염 이환율과 사망률의 중요한 원인으로 계속 굽습니다. 다제 내성 (MDR) 박테리아의 증가 출현은 전통적인 항생제 치료의 잦은 오류로 이끌었다. 대체 치료제가 절실히 MDR 박테리아를 해결하기 위해 필요하다.
혁신적인 비 항생제 접근 방식은, 항균 푸른 빛 (ABL)는 MDR의 감염에 대한 유망한 효과를 보여 주었다. ABL의 작용 기전은 아직 잘 이해되지 않는다. 이는 일반적으로 자연 (예를 들어, 철없는 포르피린, 플라 빈과 프르 등) 박테리아에서 내인성 감광 발색단을 발생하는 것은 광화학 프로세스를 다시 세포 독성 활성 산소 종을 생성 ABL (ROS)에 의해 여기되는 것을 가정한다.
또 다른 빛 기반 항균 접근 방식과는 달리, 항균 광 역학 치료 (aPDT)는, ABL 치료는 외래 photosensitiz의 개입을 필요로하지 않습니다어. 그것은을 적용 할 필요가 모든 푸른 빛의 조사입니다 따라서, 간단하고 저렴하다. 에이 비엘 수용체는 박테리아 세포의 내인성 감광제보다는 DNA이다. 따라서, ABL은 훨씬 적은 유전 독성 직접 숙주 세포의 DNA 손상을 일으키는 자외선 C (UVC) 조사보다 숙주 세포에 의한 것으로 생각된다.
본 논문에서는 화상 부상의 마우스 모델에서 MDR 된 Acinetobacter baumannii의 감염 ABL 치료의 효과를 평가하기위한 프로토콜을 제시한다. 조작 된 생물 발광 균주를 사용하여, 우리는 비 침습적 살아있는 동물에서 실시간으로 감염의 정도를 모니터링 할 수 있었다. 이 기술은 또한 동물에서 감염의 공간 분포를 모니터링하기위한 효과적인 도구이다.
서론
자주하기 때문에 피부의 열 손상의보고 굽기 감염, 이환율과 사망률 1의 중요한 원인이 될 것을 계속한다. 화상 감염 관리 더욱 의한 항생제의 대규모 사용 다제 내성 (MDR) 2 균주의 출현 증가에 의해 손상되었다. 한가지 중요한 MDR 그람 음성균 최근 전투 상처와 관련된 것으로 알려진 거의 모든 가능한 3 항생제에 내성이있다 아시네 토 박터 바우 마니이다. 부상당한 초점에서 바이오 필름의 존재는 지속적인 감염 8, 9가 발생, 4, 5를보고되었으며, 항생제 및 숙주 방어 6, 7에 대한 내성을 악화시킬 것으로 생각된다. 따라서, pressin이있다g 대체 치료법의 개발이 필요합니다. 퇴치 항생제 내성 박테리아에 대한 최근 발표 된 국가 전략에서, 항생제 대체 치료제의 개발은 미국
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프로토콜
세균성 문화 1. 준비
- 뇌 심장 주입 (BHI) 50 mL의 원심 분리기 튜브에 매체의 7.5 ML을 추가합니다. 종자 A. baumannii가 상기 BHI 배지에서 세포 후 18 시간 동안 오비탈 인큐베이터 (37 ° C)의 A. baumannii에 문화를 배양.
- 5 분 동안 3,500 × g에서 세포의 배양 상등액을 원심 분리기를 제거하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 펠렛을 세척 하였다.
- 신선한 PBS의 세균 펠렛을 다시 중단하고 철저하게 정지를 피펫.
- 세균 현탁액 100 μL를 수집하고 신선한 PBS를 사용하여시 10 분 희석을합니다.
- 1.5 mL의 반 마이크로 큐벳에 희석을 전송하고 600 nm의 OD (600 ㎚)의 파장에서의 광학 밀도 (OD)를 측정한다.
- 희석의 측정 된 OD 600 nm의 값 및 상기 희석 계수 (10)에있어서 원래 PBS (원액) 현탁액의 OD 600 nm의 계산.
- 일을 조정PBS에 현탁 전자 원은 600 나노 = (108 CFU / ㎖의 세포 농도에 해당) 0.6 중독한다.
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결과
앞서 12, 17보고 우리가 사용한 A. baumannii에 균주는 임상 단리 MDR이다. 박테리아 균주 luxCDABE를 오페라 (11)의 형질 감염에 의해 생물 발광을 하였다. 도 1a는 대표적인 마우스에서 발광 박테리아 연속 화상이 5 × 106 A. baumannii에 감염된 화상 세균 접종 후 24 시간에 한 ABL 노광에 노출 나타낸다. 대표적인 마우스 피부의 조직 학적 단면의 그람 염색 (24 시간 후 접종 수확) 시편을 연소 감염된 화상 (도 1b)의 표면 상 A. baumannii에 생물막의 존재를 입증 하였다. 도 1a에 도시 된 바.......
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토론
ABL은 감염을 치료하는 신규 한 방법이다. 그 작용 메커니즘은 화학 요법과는 완전히 다르기 때문에, 그것은 물리 치료의 더 많은 것이다. 항균 효과를 중재 에이전트는 청색 광 조사 (400-470 ㎚)이다. 청색 LED의 개발, 우리는 MDR 감염에 대한 효과적이고 간단한 빛 기반 항균 접근 방식에 대한 액세스 권한을 얻었다.
이 프로토콜에서는, 우리는 MDR, A. baumannii에의 생물 발광 변형에 의한 화상 감염 마우스 모델의 개발을 설명했다. 생물 발광 박테리아를 이용하여, 감염의 정도가 될 수있는 비 침습적 생체 발광 이미징 (imaging)을 통해 살아있는 동물에서 실시간으로 모니터링. 생물 발광 박테리아의 설계 변형 및 저조도 영상 법의 사용은 항생제 치료 중에 실시간으로 감염을 모니터링하기위한 효율적인 방법을 생성한다. 이 방법은 또한 감염의 연구에 사용할 수 있습니다다른 미생물 종에 의해 발생하는 다른 사이트에 있습니다. 항균 접근 방법의.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 미 육군 의료 연구 획득 활동 협력 협정(CIMIT No. 14-1894 to TD)과 미국 국립보건원(1R21AI109172 to TD)에 따라 의학 및 혁신 기술 통합 센터(CIMIT)의 일부 지원을 받았습니다. YW는 ASLMS 학생 연구 보조금(BS. S02.15). 우리는 YW를 위한 공동 멘토링에 대해 Wellman Center의 Tayyaba Hasan 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아이비스 | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | 전임상in vivo 이미징 |
| 발광 다이오드 LED | VieLight Inc, 캐나다 토론토 | 조명용 | 415nm |
| 전력/에너지 미터 | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | 빛 방사 조도 감지기 |
| 마우스 | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8주 령, 17-19g 체중 |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | 임상 격리 | 엔지니어드 발광 균주 |
| 인슐린 주사기 | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 주사기용 인슐린 주사기 |
| Sodium Chloride Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium | |
| Chloride Phosphate Buffered Saline, 1x Solution | Fisher Scientific | BP24384 | 많은 생체 분자 절차에 사용되는 표준 인산염 완충액 |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | 세균 배양 매체 |
| Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 14-959-70C | 세균 현탁액 원심분리기용 |
| 벤치탑 인큐베이션 오비탈 쉐이커 | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | 세균 배양을 위한 |
| 접종 루프 | Fisher Scientific | 22-363-605 | 생쥐의 화상 표면에 세균성 inoclum 번뜨리기를 위해 |
| Fisher Scientific Redi-Tip 피펫 팁, 1-200 &마이크로; L | Fisher Scientific | 02-707-502 | 피펫 팁 |
| 써모 사이언티픽 Sorvall Legend X1 원심분리기 | Fisher Scientific | 75-004-220 | 세균성 현탁액 분리용 |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | 마우스의 화상 생성을 위해 |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | 내열성 장갑 |
| Greiner 접시 | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm × 10mm |
| Corning 디지털 핫 플레이트 | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, 끓는 물용 |
| 마우스/랫 얇은 선 물 가열 수술 침대 | E-Z 시스템 | EZ-211 | 수술 중 열 손실과 저체온증을 예방합니다 |
| 수의사 연고 | S& K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, 안 | 구 건조증 예방을 위한 Augensalbe 안연 연고 |
참고문헌
- Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
- Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria.....
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재인쇄 및 허가
