낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화
Summary
이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다.
Abstract
배양 개별 신경 세포의 구조와 생리을 프로빙하는 능력은 신경 생물학 연구에 매우 중요하고 개별적인 세포 또는 정의 된 네트워크의 유전 화학적 조작 유연성을 허용한다. 그대로 뇌 조직에 비해 조작의 이러한 편의성은 감소 된 문화 시스템에 간단하다. 이 차 신경 세포의 분리 및 성장을위한 많은 방법이 존재하지만, 각각 자신의 한계가있다. 이 프로토콜은 아교 세포의 단층 위에 부유 커버 글라스에 저밀도 및 고순도 쥐 배아 해마 신경 세포를 배양하는 방법을 설명한다. 이 '샌드위치 문화는'기본 아교 단일 층에서 영양 지원을 허용하면서 뉴런의 인구의 독점적 인 장기 성장을 할 수 있습니다. 신경 세포가 충분한 연령, 성숙도의 경우, 신경 세포의 커버 슬립은 아교 요리의 아웃을 뒤집어 및 이미징 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 뉴런 g이 방법으로 rown은 일반적으로 몇 주 동안 생존하고 광범위한 아버, 시냅스 연결 및 네트워크 속성을 개발한다.
Introduction
뇌는 신경 세포의 복잡한 네트워크로 구성되어있다. 네트워크 동작 및 뇌 기능 개별 뉴런의 기여는 자신의 분자 조성 및 생리 학적 특성의 동요를 선택적으로 변경하여 조사 할 수있다. 개별 뉴런의 유전 및 화학 조작은 후자의 세포 이질성과 복잡성에 의해 방해 그대로 뇌 조직에 비해 배양 신경 세포에서 틀림없이 더 쉽다. 배양 뉴런은 잘 정의 축삭 및 수상 아버 개발 서로 광범위한 시냅스 연결을 형성한다.
성인 동물 또는 신경계의 기타 영역에서 신경 세포 배양이 가능하지만, 배아 해마 배양 자주 정의 피라미드 세포 집단 및 상대적으로 낮은 밀도 신경교 (1, 2)로 인해 바람직하다. 배양에 저밀도로 성장 해마 뉴런이다 특히 AME세포 내 현지화, 단백질 인신 매매, 신경 극성 시냅스 개발 연구에 네이블. 배양 신경 세포는 광범위 시냅스 3, 4, 5, 6 분 방법을 연구에 사용되었다. 출생 후 생존하지 않는 글로벌 유전자 삭제와 마우스의 신경 세포 배양 준비는 특정 유전자 (7)의 세포와 시냅스 역할을 공부에 특히 유용되고있다.
뇌에서와 같이 배양 된 해마 신경 아교 세포의 영양 지원에 따라 달라집니다. 이것은 그들의 문화를 복잡하게하고,이 지원이 공급하는 여러 가지 방법의 개발을 주도하고있다. 하나의 일반적으로 사용되는 방법은 교세포 8, 취득한 HIPP로부터 오염물 교세포를 허용하는 단일 층에 직접 신경 도금 포함ocampal 조직 증식 및 신경 세포 (9) 아래에 단일 층을 형성한다. 이 방법은 약간의 성공을 발견 하였지만, 결과 신경 세포 배양의 불순물 촬상 실험 불리하다. 신경 세포 배양의 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 전체 층 폐해 급지 아웃두고 대신 정의 된 성장 배지 (10)의 형태의 영양 지원을 제공하는 것이다.
여기, 우리는 "샌드위치"또는 신경 문화 2, 11의 "은행"방법을 설명합니다. 이 방법은 파라핀 왁스 비드로 분리 아교 세포 단층 위에 부유 커버 글라스에 해마 뉴런 도금 포함한다. 이 기본 아교 단일 층에서 영양 지원을 허용하면서 아교 세포를 오염없이 뉴런의 동질적인 인구의 장기 문화를 용이하게합니다. 신경 세포가 충분한 연령, 성숙도의 경우,신경 세포의 커버 슬립은-뒤집어 밖으로 아교 요리 및 이미징 또는 기능 분석에 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배양 신경 세포의 "샌드위치"방법은 다른 곳에서 잘 설명 하였지만 2, 11, 그것을 채택하고자하는 연구자에 대한 불만으로 이어질 수 있습니다 만 텍스트를 설명하는 것은 매우 어려운 프로토콜에 걸쳐 여러 단계가있다.
아교 문화, 커버 슬립 준비 및 신경 세포의 문화 및 유지 보수 :이 방법은 세 가지 흐름으로 나눌 수 있습…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CIHR의 MOP-142209 TJS에 의해 지원되었다.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
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