منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول لزراعة منخفض الكثافة الخلايا العصبية الحصين الابتدائية المتزايد على coverslips الزجاج المقلوب على أحادي الطبقة الدبقية. يتم فصل طبقات الخلايا العصبية والدبقية التي كتبها حبات شمع البارافين. الخلايا العصبية التي يزرعها هذه الطريقة هي مناسبة لعالية الدقة التصوير الضوئي والمقايسات الفنية.
Abstract
القدرة على تحقيق هيكل وفسيولوجيا الخلايا العصبية الفردية في الثقافة أمر بالغ الأهمية لدراسة بيولوجيا الأعصاب، ويسمح للمرونة في التلاعب الجيني والكيميائي للخلايا فردية أو شبكات محددة. بهذه السهولة التلاعب أبسط في نظام الثقافة انخفاض بالمقارنة مع أنسجة الدماغ سليمة. بينما العديد من الأساليب لعزل ونمو هذه الخلايا العصبية الأولية موجودة، كل له حدوده الخاصة. يصف هذا البروتوكول طريقة لزراعة منخفض الكثافة والقوارض عالية النقاء الخلايا العصبية الجنينية الحصين coverslips على الزجاج، والتي يتم بعد ذلك علقت اكثر من أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية. هذه "الثقافة شطيرة" تسمح للنمو على المدى الطويل الحصري لعدد السكان من الخلايا العصبية في حين يسمح للحصول على الدعم الغذائي من أحادي الطبقة الدبقية الأساسية. عندما الخلايا العصبية هي من العمر ما يكفي أو مستوى النضج، لل coverslips الخلايا العصبية يمكن أن انقلبت التدريجي من الطبق الدبقية والمستخدمة في التصوير أو المقايسات الفنية. الخلايا العصبية زrown بهذه الطريقة البقاء على قيد الحياة عادة لعدة أسابيع وتطوير العرش واسعة، اتصالات متشابك، وخصائص الشبكة.
Introduction
وينظم الدماغ في شبكات معقدة من الخلايا العصبية. مساهمة من الخلايا العصبية الفردية لنشاط الشبكة وظائف المخ يمكن دراستها عن طريق تغيير الانتقائي للتكوينها الجزيئية وperturbance ممتلكاتهم الفسيولوجية. التلاعب الجيني والكيميائية من الخلايا العصبية الفردية أسهل القول في الخلايا العصبية مثقف مما كانت عليه في أنسجة الدماغ سليمة، تعيقها عدم التجانس الخلوية الأخير والتعقيد. الخلايا العصبية في ثقافة تطوير محور عصبي واضحة المعالم والعرش الشجرية وتشكل الاتصالات المشبكية مكثفة مع بعضها البعض.
في حين ثقافة العصبية من الحيوانات البالغة أو من مناطق أخرى من الجهاز العصبي هو ممكن، وكثيرا ما يفضل الثقافات الحصين الجنينية بسبب السكان المحمولة الخاصة بهم محددة هرمي وكثافة منخفضة نسبيا الدبقية 1 و 2. الخلايا العصبية قرن آمون نمت في منخفض الكثافة في الثقافة بشكل خاص آميnable لدراسة توطين التحت خلوية، والاتجار البروتين، والاستقطاب الخلايا العصبية والتنمية المشبك. كما تم توظيف الخلايا العصبية في الثقافة على نطاق واسع في دراسة العمليات الجزيئية في اللدونة متشابك 3، 4، 5، 6. وكانت الاستعدادات ثقافة العصبية من الفئران مع الحذف الجينية العالمية التي لا البقاء على قيد الحياة بعد الولادة مفيدة بشكل خاص في دراسة أدوار الخلوية ومتشابك بعض الجينات 7.
كما هو الحال في الدماغ، الخلايا العصبية الحصين مثقف تعتمد على الدعم الغذائي من الخلايا الدبقية. هذا يعقد ثقافتهم، وأدى إلى تطوير العديد من الطرق المختلفة التي يتم من خلالها توفير هذا الدعم. ويشمل أحد الطريقة المستخدمة عادة طلاء الخلايا العصبية مباشرة على أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية 8، أو السماح للخلايا الدبقية الملوثات من هيب المكتسبةالأنسجة ocampal لتتكاثر وتشكيل أحادي الطبقة تحت الخلايا العصبية 9. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة بعض النجاح، والنجاسة من ثقافة العصبية الناتج هو غير ملائم للتجارب التصوير. آخر الطريقة المستخدمة عادة من ثقافة العصبية ومن المقرر ان يغادر المغادرة وحدة التغذية الدبقية طبقة تماما، وبدلا من تقديم الدعم الغذائي في شكل متوسط النمو المحدد 10.
هنا، نحن تصف "ساندويتش" أو طريقة "بانكر" للثقافة العصبية 2 و 11. يتضمن هذا الأسلوب طلاء الخلايا العصبية قرن آمون coverslips على الزجاج، والتي يتم بعد ذلك علقت اكثر من أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية مفصولة حبات شمع البارافين. وهذا يسهل الثقافة على المدى الطويل من السكان متجانسة من الخلايا العصبية دون تلويث الدبقية في حين يسمح للحصول على الدعم الغذائي من أحادي الطبقة الدبقية الأساسية. عندما الخلايا العصبية هي من العمر ما يكفي أو مستوى النضج،لل coverslips الخلايا العصبية يمكن أن انقلبت التدريجي من الطبق الدبقية وتستخدم في التصوير أو المقايسات الفنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن أسلوب "ساندويتش" من الخلايا العصبية زراعة وصفت أيضا في أماكن أخرى 2، 11، هناك العديد من الخطوات في جميع أنحاء البروتوكول الذي يصعب جدا لوصف في النص وحده، الذي يمكن أن يؤدي إلى الإحباط للمحققين الذين يرغبون في اعتماده.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل CIHR MOP-142209 لTJS.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons–views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
