ड्रोसोफिला तैयारी और दिल समारोह विवो में ऑप्टिकल जुटना माइक्रोस्कोपी का उपयोग के अनुदैर्ध्य इमेजिंग (ओसीएम)
Summary
Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Abstract
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
Introduction
छोटे जानवरों में दिल के अनुदैर्ध्य अध्ययन में इस तरह के जीन से संबंधित जन्मजात हृदय दोष 1,2 के रूप में मानव संबंधित हृदय रोगों की एक किस्म को समझने के लिए योगदान देता है। पिछले दशकों में, इस तरह माउस 3,4, 5,6 Xenopus, zebrafish 7,8, एवियन 9, और ड्रोसोफिला 10-16 के रूप में विभिन्न पशु मॉडल में, मानव हृदय-विकास से संबंधित अनुसंधान का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। माउस मॉडल व्यापक रूप से सामान्य और असामान्य हृदय विकास और मानव हृदय 3,4 के साथ अपनी समानता के कारण हृदय दोष phenotypes अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Xenopus भ्रूण इसकी आसान हैंडलिंग और आंशिक पारदर्शिता 5,6 के कारण दिल के विकास के अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है। भ्रूण और zebrafish मॉडल के शुरुआती लार्वा की पारदर्शिता हृदय विकास 7.8 की आसान ऑप्टिकल अवलोकन के लिए अनुमति देता है। एवियन मॉडल विकासात्मक दिल के अध्ययन का एक आम विषय है becausई दिल आसानी से अनावश्यक कार्य और मनुष्यों से 9 एवियन दिल की रूपात्मक समानता को हटाने के बाद पहुँचा जा सकता है। ड्रोसोफिला मॉडल है जो यह दिल की अनुदैर्ध्य अध्ययन के प्रदर्शन के लिए आदर्श बनाते हैं कुछ अद्वितीय विशेषताएं है। सबसे पहले, ड्रोसोफिला के दिल ट्यूब पृष्ठीय सतह के नीचे ~ 200 माइक्रोन, जो ऑप्टिकल उपयोग और दिल के अवलोकन के लिए सुविधा प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, कई आणविक तंत्र और आनुवंशिक रास्ते ड्रोसोफिला और रीढ़ के बीच संरक्षित कर रहे हैं। मानव रोग जीन का 75% से अधिक की orthologs ड्रोसोफिला, जो यह व्यापक रूप से ट्रांसजेनिक अध्ययनों 11,13 में इस्तेमाल बना दिया है में पाए गए। इसके अलावा, यह एक छोटे से जीवन चक्र और कम रखरखाव लागत है, और आमतौर पर विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान 14-16 के लिए एक नमूना मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है।
पिछली रिपोर्टों जैसे ड्रोसोफिला हृदय कार्यों की निगरानी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है वहArtBeat। हालांकि, विच्छेदन प्रक्रियाओं 17,18 आवश्यक थे। ऑप्टिकल इमेजिंग अपने गैर-आक्रामक प्रकृति के कारण पशुओं में हृदय विकास कल्पना करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। अलग ऑप्टिकल इमेजिंग तौर तरीकों में इस तरह के दो photon माइक्रोस्कोपी 19, confocal माइक्रोस्कोपी 20,21, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी 22, और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) 16,23-26 के रूप में प्रदर्शन पशु हृदय अध्ययन में लागू किया गया है। तुलनात्मक रूप से, अक्टूबर, विपरीत एजेंटों का उपयोग किए बिना छोटे जानवर दिलों में महान इमेजिंग गहराई प्रदान करने के लिए एक उच्च संकल्प और एक ultrahigh इमेजिंग गति है, जो इमेजिंग जीवित पशुओं के लिए महत्वपूर्ण हैं रखते हुए करने में सक्षम है। इसके अतिरिक्त, एक अक्टूबर प्रणाली विकसित की कम लागत के नमूनों की ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए इस तकनीक को लोकप्रिय बनाया गया है। अक्टूबर सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। का उपयोग अक्टूबर, हृदय रूपात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग दिल संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया है, समारोहजीन की राष्ट्रीय भूमिका, और हृदय के विकास के दौरान उत्परिवर्ती मॉडल में हृदय दोष के तंत्र। उदाहरण के लिए, उम्र पर निर्भर हृदय समारोह में गिरावट नीचे विनियमित एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम से संबंधित (ACER) ड्रोसोफिला में अक्टूबर 27 के साथ जीन के साथ की पुष्टि की थी। जीन से संबंधित कार्डियोमायोपैथी के phenotyping अक्टूबर 28-33 का उपयोग कर ड्रोसोफिला में प्रदर्शन किया गया। अनुसंधान OCT का उपयोग भी ड्रोसोफिला 34 के दिल में मानव जीन SOX5 के कार्यात्मक भूमिका का पता चला। अक्टूबर के साथ तुलना में, ओसीएम बेहतर अनुप्रस्थ संकल्प प्रदान करने के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य उपयोग करता है। अतीत में, दिल एक ortholog मानव circadian जीन dCry / dClock मुंह बंद करने की वजह से रोग एक कस्टम ओसीएम प्रणाली 15,16, साथ ही ड्रोसोफिला में cardiomyopathies पर उच्च वसा वाले आहार के प्रभाव का उपयोग कर मोटापा प्रेरित मानव समझने के लिए अध्ययन किया गया है हृदय रोगों। 15
इधर, वेंई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल दूसरे instar (एल 2), तीसरे instar (L3), प्यूपा दिन 1 (PD1), प्यूपा दिन 2 (PD2), प्यूपा दिन 3 पर ड्रोसोफिला में हृदय रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए संक्षेप (PD3) , प्यूपा दिन 4 (PD4), प्यूपा दिन 5 (PD5), और वयस्क (चित्रा 1) ओसीएम का उपयोग करते हुए मानव से संबंधित जन्मजात हृदय रोगों के अध्ययन की सुविधा के लिए। इस तरह के मानव संसाधन और टोपी के रूप में कार्डिएक कार्यात्मक मापदंडों, मात्रात्मक विकास के विभिन्न चरणों में विश्लेषण किया गया हृदय विकास सुविधाओं प्रकट करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ड्रोसोफिला के तेजी से दिल की धड़कन, लार्वा और वयस्क चरणों में 400 बीपीएम के चारों ओर एक अधिकतम मानव संसाधन के साथ, दिल diastoles और systoles (कोई कम से कम 80 फ्रेम / सेकंड के अनुभवों के आधार पर) को हल करने के लिए उच्च गत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Materials
| Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
| my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
| Cover glass | AmScope | 200PCS | |
| Cotton Ball | RITE AID | ||
| Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
| Yeast | ActiveDry | ||
| Microscope | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
| Labview software | National Instruments | ||
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
| Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
| Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
| Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
| Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
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