레이저 이외에 Microdissection RNA-서열에 대한 실험 디자인 : 옥수수 잎 개발의 분석 교훈

요약

발달적으로 중요한 많은 유전자는 세포 또는 조직 특이적 발현 패턴을 가지고 있습니다. 본 논문은 야생형과 비교하여 옥수수잎-칼집 경계와 lg1-R 돌연변이에서 다르게 발현되는 유전자를 확인하기 위한 LM RNA-seq 실험에 대해 설명합니다. 여기에서 논의된 실험적 고려 사항은 다른 발달 현상의 전사체 분석에 적용됩니다.

초록

개발에 중요한 역할 유전자는 자주 공간적 및 / 또는 시간적으로 제한된 발현 패턴이 있습니다. 종종 이러한 유전자 성적 증명서가 감지되지 않거나 차별적으로 전체 식물 기관의 transcriptomic 분석에서 (DE) 표시로 확인되지 않습니다. 레이저 이외에 Microdissection RNA-SEQ (LM RNA-SEQ)는 특정 발달 영역에서 DE이다 유전자를 식별 할 수있는 강력한 도구입니다. 그러나, 셀룰러 도메인의 선택은 microdissect과 비교하고 microdissections의 정확도는 실험의 성공에 매우 중요한다. 여기서 두 가지 예 transcriptomics 실험에 대한 디자인 고려 사항을 설명; RNA-서열 분석은 옥수수 잎 근위 말단부 축을 따라 DE되는 유전자를 동정하는 LM 및 두번째 실험에서 liguleless1 DE-R (LG1-R)이다 유전자를 동정 할 돌연변이는 야생형에 비해. 이 실험의 성공에 기여한 핵심 요소는 조직 학적 및시에 설명 된TU 하이브리드 분석 할 수있는 영역 분석, 동등한 발달 단계에서 잎 primordia의 선택, 형태 학적 랜드 마크의 사용은 미세 절제에 대한 영역을 선택하고 정확하게 측정 영역의 미세 절제합니다. 이 논문은 LM RNA-서열에 의해 개발 도메인 분석을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 여기에 제시된 데이터는 미세 절제 선택 영역이 얻은 결과에 영향을 미칠 것입니다 방법을 보여줍니다.

서론

이 유전자 해부 (그림 1A)에 의무가 블레이드와 외피 사이에 뚜렷한 경계가 같이 옥수수 잎, 형태 형성 과정 개발 분야의 형성을 연구하는 이상적인 모델이다. 잎 발달 작은 셀 선형 대역의 초기 단계 동안, preligule 대역 (PLB)은, 미리 블레이드 프리 시스 도메인에 리프 primordium을 세분화. 프린지 같은 잎혀와 삼각 이개는 PLB (그림 1A, C, D)에서 개발. 유전 화면은 블레이드 시스 경계를 ​​방해 돌연변이를 확인했다. 예를 들면, 열성 liguleless1 (LG1) 돌연변이는 잎혀 귓바퀴 및 ^{1, 2, 3, 4} (도 1b)을 삭제. 현장에서 하이브리드 LG1 성적은 P에서 축적 것으로 나타났다LB와 잎혀 개발 ^{5, 6}

프로토콜

주 : 조직 LM 고정되는 동시에, 조직 학적 분석을 위해 조직을 수정. 나중에 LM을 안내 할 것입니다 형태 학적 기능에 대한 스테인드 섹션을 검사합니다. 야생형 변이체와 비교하면, (이 경우 LG1)에 관심있는 유전자를 발현하는 도메인을 정의하는 계내 혼성화 또는의 면역에서 수행한다.

1. 조직의 고정 및 처리

1. 표준 조건 ^(6)에서 이전 2 주 옥수수 모종의 아파트를 성장.
2. 측면 부분 (그림 4)에 대한 촬영 정점을 해부하다.
   1. 단지 토양 라인 아래 소비세 종묘.
   2. 면도날을 사용하여 하나 또는 두 개의 성숙한 잎에 의해 둘러 쌓여 줄기의 타원형이 표시 (그림 4B)가 될 때까지 줄기 (인하 1,도 4A)의 기지에서 얇은 조각을 제거합니다.
   3. 다른 컷베이스 위의 약 10 mm의 (도 4a 2 컷)합니다.이 10mm 세그먼트는 SAM과 어린 잎 primordia 포함됩니다.
   4. 기본이 위를 향하도록 10mm 세그먼트를 켭니다. 조직 ....

결과

약 1,000,000-1,500,000 ^μm의이 조직의 각각에 대해 수집 된 그림 2에 나와있는 LM 방식을 사용하면 모든 세포 층 LM에 (그림 5)를 복제하고, 20 μm의 ² 당은 향축 표피 LM에 대한 복제합니다. 각각 LG1-R 및 야생형 잎 primordia의 LM에 복제 약 2,500,000 μm의 ^{조직이 수집되었다.} 선형 RNA 증폭의 두 라운드는 각 복제에 대 한 RNA의 마이크로 그램 수량을 얻었다. 주어진 미세 절제로부터 얻은 RNA의 양은 셀 크기 및 전사 활성뿐만 아니라 캡쳐 된 조직의 양에 의존 할 것이다. RNA의 무결성은 RNA 증폭의 효율에 영향을 미칠 것이다.

성적 증명서 축적은 블레이드, 잎혀.......

토론

실험 설계는 RNA-서열 실험에서 중요한 요소이다. 중요한 고려 사항은 정확한 도메인 (들) 및 발달 단계 (들)을 분석하는 것과 비교가 이루어질 것이다이다. 출력은 두 개 이상의 상태 사이 DE되는 유전자의 목록은 전형적 이래로, 비교의 관점에서 생각하는 것이 중요하다. 모든 실험에서와 같이, 한 번에 단 하나의 변수를 변경하는 것이 중요하다. 다른 리프 도메인을 비교할 때, 예를 들어, 동일한 조건 하에서 성장 동일한 나이 및 발달 단계가 비교되어야한다 남긴다.

이 실험의 목적은 구체적으로 상향 또는 야생형 잎 primordia의 잎혀 영역에서 하향 조절되어 유전자를 확인하고, 야생형에 비해 LG1-R 돌연변이에 DE가있는 유전자를 동정 하였다. 우리가 먼저 개발 잎 primordia의 형태와 LG1 성적 증명서 축적의 패턴을 공부했다. 이러한 형태 학적 및 분자 랜드 마크 w감수는 LM ^14,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220	의 RNase 처리에 사용됩니다
	전자 현미경 과학	72000
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020-250ML	RNase 오염 제거 용액
에탄올 절대 200 증거	Fisher Scientific	BP28184
아세트산, 빙하	Sigma-Aldrich	A6283
유리 바이알 - 22 ml	VWR	470206-384
Xylenes, 조직학적 등급	Sigma-Aldrich	534056-4L
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1KG
일회용 베이스 몰드, 15 mm x 15 mm x 5 mm	VWR	15154-072
임베딩 링	VWR	15154-303
실리카겔 패킷	Electron Microscopy Sciences	71206-01	파라핀 블록 보관용 건조제
오븐	Fisher Scientific	15-103-0503	오븐은 60°C의 온도를 유지해야 합니다. C
파라핀 임베딩 스테이션	Leica	EG1160
마이크로톰	라이카	RM2235
슬라이드 워머	전자 현미경 과학	71317-10
코플린 항아리	전자 현미경 과학	70316-02
레이저 마이크로디스섹터	Zeiss
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