परीक्षण संवहनी इनवेसिव (Zebrafish में कैंसर कोशिकाओं की क्षमता<em> Danio rerio</em>)
Summary
इस विधि को कुशलता से कैंसर की कोशिकाओं की नाड़ी आक्रामक क्षमता का परीक्षण करने के लिए zebrafish भ्रूण का इस्तेमाल करता है। फ्लोरोसेंट कैंसर की कोशिकाओं को विकसित भ्रूण के precardiac साइनस या जर्दी थैली में इंजेक्ट कर रहे हैं। कैंसर कोशिका संवहनी आक्रमण और परिस्त्राव 24 करने के लिए 96 घंटा के बाद में पूंछ क्षेत्र के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन किया है।
Abstract
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
Introduction
Metastatic रोग कैंसर से मृत्यु और कई तंत्र है कि कैंसर कोशिका प्रसार सक्षम 1 की खोज की जा करने के लिए रहने का एक प्रमुख कारण है। एक कैंसर सेल के लिए आदेश में सफलतापूर्वक metastasize करने के लिए, यह पहली बार है कि एक स्ट्रोमा प्राथमिक ट्यूमर के चारों ओर, (intravasate) दर्ज संचार प्रणाली में के माध्यम से आक्रमण करना होगा, प्रचलन से पारगमन, बाहर निकलें (बहना) में जीवित है, और अंत में एक व्यवहार्य कॉलोनी की स्थापना दूर के अंग साइट पर 2। Intravasation और परिस्त्राव इस प्रकार मेटास्टेटिक झरना में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं, फिर भी हर कैंसर कोशिका में खलल न डालें और endothelial जंक्शनों 3 के माध्यम से पलायन पर स्वाभाविक रूप से दक्ष नहीं है। वास्तव में, वहाँ अद्वितीय चयन दबाव है कि कैंसर कोशिका संवहनी आक्रमण के चारों ओर और आगे की प्रक्रिया 4 अंतर्जात और exogenous कारकों की एक किस्म से प्रभावित किया जा सकता है की एक श्रृंखला रहे हैं। इन कारणों के लिए, तकनीक है कि उन्नत चरण के कैंसर के आक्रामक व्यवहार की जांच अक्सर वी पर ध्यान केंद्रितमेटास्टेटिक प्रसार भविष्यवाणी करने के लिए एक साधन के रूप में आक्रामक क्षमता ascular।
विभिन्न मॉडल प्रणाली इन विट्रो में कैंसर सेल संवहनी आक्रमण के अध्ययन की सुविधा के लिए मौजूद हैं। सबसे विट्रो assays में इस्तेमाल कैंसर की कोशिकाओं को 6 से एक अक्षुण्ण endothelial monolayer के वास्तविक समय व्यवधान की निगरानी के लिए एक endothelial बाधा 5 या इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट मुक़ाबला सेंसिंग (ECIS) तकनीक के माध्यम से कैंसर सेल प्रवास का आकलन करने के लिए या तो शामिल transwell सिस्टम। ये assays आम तौर पर तरल गतिकी और stromal कारक है कि अन्यथा एक endothelial दीवार से कैंसर सेल लगाव प्रभाव होगा की कमी है। यह समस्या कुछ हद तक perfusable संवहनी नेटवर्क है कि stromal कोशिकाओं के समर्थन के साथ endothelia के 3 डी संस्कृति से उठता रोका जाता है, और इन 3 डी सिस्टम microfluidic अब वर्तमान में इन विट्रो विकल्प 7.8 के मामले में सबसे आगे प्रतिनिधित्व करते हैं। फिर भी, इन तरीकों एक कार्यात्मक संचार प्रणाली के मजबूत microenvironment न आनाऔर इसलिए केवल इन विवो मॉडल के लिए भाग स्थानापन्न में।
सबसे व्यापक रूप से संवहनी आक्रमण के vivo मॉडल में इस्तेमाल माउस, जिसमें प्रायोगिक मेटास्टेसिस assays आमतौर पर प्रदर्शन कर रहे हैं, क्योंकि वे अपेक्षाकृत कम timescales पर होते हैं और मेटास्टेटिक क्षमता 9 के आम तौर पर संकेत कर रहे है। ये assays संचलन में कैंसर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है और इसलिए मेटास्टेसिस, अंगों की अर्थात् परिस्त्राव और कैंसर कोशिका उपनिवेशवाद का अंत चरणों मॉडल। प्रायोगिक मेटास्टेसिस assays कैंसर सेल इंजेक्शन के स्थल के आधार पर अलग और अंगों अंततः का विश्लेषण किया। पहली परख प्रकार में, कैंसर की कोशिकाओं को फेफड़ों में चूहों और कैंसर सेल बोने की पूंछ नस में इंजेक्शन हैं 10,11 नजर रखी है। दूसरी परख हड्डी microenvironment 12-14 की ओर मेटास्टेटिक बोने को निर्देशित करने के intracardiac इंजेक्शन प्रदर्शन शामिल है, लेकिन यह भी मस्तिष्क 15। तीसरे परख में, कैंसर गएल आदेश जबकि मन्या धमनी में चौथे वितरण मार्ग मस्तिष्क 17,18 करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं को किया जाता है जिगर 16 के औपनिवेशीकरण की अनुमति के लिए में तिल्ली में इंजेक्ट कर रहे हैं। कैंसर कोशिका वितरण पद्धति के चाहे, अंग बसाना स्वीकार कर लिया प्रयोगात्मक समापन बिंदु है और आम तौर पर luminescence, ऊतक विज्ञान, या पीसीआर आधारित तकनीक के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। एक murine मेजबान के भीतर प्रायोगिक मेटास्टेसिस assays के संचालन के शारीरिक लाभ के बावजूद, इन प्रयोगों अभी भी सप्ताह महीने तक पूरा करने और विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है।
Zebrafish (Danio rerio) मॉडल ने हाल ही में कैंसर की प्रगति 19,20 अध्ययन करने के लिए एक नई प्रणाली के रूप में उभरा है, और जब चूहों 21-24 के साथ तुलना में एक बहुत छोटा timescale पर एक कार्यात्मक संचार प्रणाली के भीतर कैंसर कोशिका संवहनी आक्रमण के आकलन के लिए अनुमति देता है। विधि एक पारदर्शी zebrafish तनाव है कि एक हरे रंग की चट्टान मूंगा Fluo के साथ टैग अपने endothelia गया है इस्तेमालrescent प्रोटीन संवाददाता kdrl प्रमोटर, संवहनी endothelial वृद्धि कारक 25 zebrafish रिसेप्टर द्वारा संचालित। परख में, कैंसर की कोशिकाओं को एक लाल फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल और 2 दिन पुराने भ्रूण के precardiac साइनस में इंजेक्ट कर रहे हैं। 48 से 96 घंटा के बीच कहीं भी इंजेक्शन के बाद, कैंसर कोशिकाओं है कि वाहिका के बाहर और भ्रूण की दुम क्षेत्र में आक्रमण किया है एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर कुशलता से रन बनाए जा सकते हैं। यहाँ हम उनकी नाड़ी आक्रामक क्षमता में निरा मतभेद प्रदर्शित करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के एक पैनल के लिए तकनीक लागू होते हैं। इसके अलावा, हम दिखाना है कि भ्रूण की जर्दी थैली को इंजेक्शन साइट बदलते विषम सेल बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, के रूप में कैंसर सेल आबादी विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जा सकता और फ्लोरोसेंट वाहिका कमी zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट किया। इस बाद परख में, कैंसर कोशिकाओं है कि जर्दी पर आक्रमण किया है और vasculatur में intravasatedई इंजेक्शन के बाद 48 घंटे के लिए दुम क्षेत्र में 24 रन बनाए हैं। प्रभावशीलता और इस मॉडल की सुविधा की वजह से, zebrafish तेजी से तेजी से एक शारीरिक सेटिंग के तहत कैंसर की कोशिकाओं की नाड़ी आक्रामक क्षमता का परीक्षण करने के लिए कार्यरत हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तकनीक zebrafish मॉडल कुशलता से कैंसर की कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) की नाड़ी आक्रामक क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल करता है। (; – 3 आंकड़े 2 1 टेबल देखें) यहाँ हम क्रम में एक आधारभूत पर ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
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