Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (<em> Danio rerio</em>)

Summary

Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.

Abstract

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Introduction

A doença metastática é uma das principais causas de mortalidade por cancro e diversos mecanismos que permitem a difusão de células de cancro continuam a ser descobertos ^1. Para que uma célula cancerosa para metastizar com sucesso, ele deve primeiro invadir através do estroma que rodeia um tumor primário, introduzir (intravasate) para o sistema circulatório, sobreviver em trânsito, saída (extravasamento) a partir da circulação, e, por último, estabelecer uma colónia viáveis no local do órgão distante ^2. Intravasation e extravasamento são, assim, passos cruciais na cascata metastática, mas cada célula cancerosa não é inerentemente adepto de interromper e migrando através de junções endoteliais ^3. De facto, há uma série de pressões de selecção únicas que circundam invasão vascular de células de cancro e o processo pode ser ainda influenciada por uma variedade de factores endógenos e exógenos ^4. Por estas razões, as técnicas que sondam o comportamento agressivo de câncer em estágio avançado, muitas vezes se concentrar em vascular capacidade invasiva como um meio para prever a propagação metastática.

Existem vários sistemas de modelo para facilitar o estudo de invasão vascular de células de cancro in vitro. Os mais utilizados em ensaios in vitro envolvem ou sistemas Transwell para avaliar a migração de células de cancro por meio de uma barreira endotelial ou ⁵ tecnologia celular Eléctrica-Substrato Impedância de detecção (ECIS) para monitorar a interrupção em tempo real de uma monocamada endotelial intacta por células cancerosas ^6. Estes ensaios normalmente não têm a dinâmica dos fluidos e fatores estromais que de outra forma afetar a fixação de células de câncer para uma parede endotelial. Este problema é um pouco iludida por redes vasculares perfusable que surgem a partir da cultura 3D do endotélio com o apoio de células do estroma, e estes sistemas microfluídicos 3D agora representam a vanguarda das atuais in vitro opções de ^7,8. Ainda, estas abordagens omitir o microambiente robusta de um sistema circulatório funcionale, portanto, apenas em substituto parcial para os modelos in vivo.

O mais amplamente usado no modelo in vivo de invasão vascular é o rato, em que os ensaios experimentais de metástases são normalmente executada porque eles ocorrem em escalas de tempo relativamente curtos e são geralmente indicativas da capacidade metastática ^9. Estes ensaios envolvem injeção direta de células cancerígenas em circulação e, portanto, modelar os estágios finais de metástase, ou seja, extravasamento e célula cancerosa colonização de órgãos. Os ensaios experimentais de metástase diferem de acordo com o local da injecção de células de cancro e em última análise, os órgãos analisados. No primeiro tipo de ensaio, as células cancerosas são injectados na veia da cauda de ratos e sementeira de células de cancro nos pulmões é monitorizada ^10,11. O segundo ensaio envolve a execução de injecções intracardíaca para dirigir a sementeira metastática para o microambiente do osso ^12-14, mas também no cérebro ^15. No terceiro ensaio, cancro cells são injectados no baço, a fim de permitir a colonização do fígado ^16, enquanto que a quarta via de administração para dentro da artéria carótida transporta as células cancerosas do cérebro ^17,18. Independentemente do método de entrega de células de cancro, a colonização de órgãos é o ponto de extremidade experimental aceite e é geralmente determinada através da luminescência, histologia, ou técnicas baseadas em PCR. Apesar das vantagens fisiológicas de condução de ensaios experimentais de metástases dentro de um hospedeiro murino, estas experiências continuam a exigir semanas a meses para completar e analisar.

O modelo de peixe-zebra (Danio rerio) surgiu recentemente como um novo sistema para estudar a progressão do câncer ^19,20, e permite a avaliação de invasão vascular de células cancerígenas dentro de um sistema circulatório funcional através de uma escala de tempo muito mais curto, quando comparado com camundongos ^21-24. O método utiliza uma cepa zebrafish transparente que tem a sua endotélio marcado com um fluo recife de coral verderepórter proteína rescent dirigido pelo promotor kdrl, o receptor de peixes-zebra para o factor de crescimento endotelial vascular ^25. No ensaio, as células cancerosas são marcadas com um marcador fluorescente vermelha e injectada no seio de 2-precardiac embriões dia de idade. Em qualquer lugar entre 48 a 96 horas após a injecção, as células cancerosas que invadiram fora da vasculatura e para dentro da região caudal de embriões podem ser marcados de forma eficiente num microscópio de fluorescência. Aqui nós aplicamos a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama humano comumente utilizados para demonstrar grandes diferenças em sua capacidade invasiva vascular. Além disso, nós demonstramos que a mudança do local de injecção ao saco vitelino de embriões permite o estudo de interacções de células heterogéneas, como as populações de células de cancro podem ser diferencialmente marcadas com corantes fluorescentes e injectado em embriões de peixe-zebra que faltam vasculatura fluorescente. Neste último ensaio, as células cancerosas que invadiram a gema e intravasated no vasculature são marcados na região caudal de 24 a 48 horas após a injeção. Devido à eficácia e conveniência de este modelo, peixe-zebra são cada vez mais utilizados para testar rapidamente a capacidade invasiva vascular das células cancerosas sob um ambiente fisiológico.

Protocol

Declaração de Ética: Zebrafish embriões foram gerados de acordo com um protocolo aprovado IACUC. Estes experimentos foram realizados em conformidade com as recomendações do Comité Animal Care e Use da Universidade Georgetown. 1. Organize embriões para injeção e criar soluções de Stock Gerar larvas do peixe requisito para avaliar a invasão vascular célula cancerosa. Configurar por pares ou grupo em-cross acasalamento com Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mit…

Representative Results

Aqui nós testamos a capacidade invasiva vascular de linhas celulares de cancro da mama habitualmente utilizada num modelo de embrião do peixe-zebra (Figura 1). rigorosos critérios foram empregados em extravasamento de pontuação para estas linhas celulares diferentes, onde os eventos positivos só foram contados se as células cancerosas tinha claramente extravasada, este ser feito principalmente a limitar os falsos positivos que podem surgir com marcando restos celu…

Discussion

Esta técnica utiliza o modelo de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular (ver Figura 1). Aqui nós aplicada a técnica de um painel de linhas celulares de cancro da mama a fim de fornecer uma linha de base sobre a qual outros investigadores pode então construir os seus próprios estudos (ver Tabela 1 e Figuras 2 – 3). A observação de que as células MDA-MB-231 facilmente invadidas na região caudal de embriões…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
100mm Dishes	Corning Incorporated	3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass	Fisher Brand	13-678-20B
60 mm Dish	Corning Incorporated	3160-60
Agarose, Low Melting	Fisher	BP165-25
Agarose, Molecular Grade	Bioline	BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller	Hofstra Group	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0MM	World Precision Instruments, Inc	E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)	Fluka	A5040
Eyelash Brush	Ted Pella, Inc	113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes	ThermoFisher Scientific	13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Brand	02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm)	ThermoFisher Scientific	150680
Glass Depression Slide	VWR	470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt	Pentair	IS50
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8 Confocal Microscope	Leica
Micromanipulator	Narishige
Eclipse E600	Nikon
PBS	Life Technologies	10010-023
Penicillin-G Potassium	Fisher Biotech	BP914-100
Petri Plates, 100mm x 15mm	Fisher Brand	FB0875713
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
Streptomycin Sulfate	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	ThermoFisher Scientific	V22885
Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886
Zebrafish	Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.