Тестирование Сосудистый инвазивным способность раковых клеток в данио рерио (<em> Danio Rerio</em>)
Summary
Этот метод использует эмбрионов данио, чтобы эффективно испытать сосудистую инвазивный способность раковых клеток. Флуоресцентные раковые клетки вводят в precardiac пазухи или желтка развивающихся эмбрионов. раковой клетки сосудистой инвазии и экстравазация оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии хвостовой области от 24 до 96 ч позже.
Abstract
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
Introduction
Метастатического заболевания является одной из основных причин смертности от рака и многих механизмов, позволяющих распространение раковых клеток остаются быть обнаружены 1. Для того, чтобы раковой клетки, чтобы успешно метастазировать, он должен сначала вторгнуться через стромы, которая окружает первичную опухоль, введите (intravasate) в кровеносную систему, выжить в пути, выход (вытекать из сосудов в ткань) из обращения, и, наконец, создать жизнеспособную колонию на отдаленном участке органа 2. Intravasation и кровоизлияние, таким образом , важные шаги в метастатического каскада, но каждая клетка рака не по своей сути искусными в срыве и миграции через эндотелиальные переходов 3. На самом деле, существует целый ряд уникальных отбора давлений , которые окружают раковых клеток сосудистой инвазии , и процесс может быть в дальнейшем под воздействием самых разных эндогенных и экзогенных факторов 4. По этим причинам методы, проверяющие агрессивное поведение продвинутой стадии рака часто сосредотачиваются на Vascular инвазивной способности в качестве средства для прогнозирования метастазирования.
Различные модельные системы существуют , чтобы облегчить изучение раковых клеток сосудистой инвазии в пробирке. Наиболее часто используемых в анализах пробирке включают либо Transwell системы для оценки миграции раковых клеток через эндотелиального барьера 5 или технологии Electric Cell-подложка сопротивление зондированию (ECIS) для наблюдения за нарушения в реальном времени неповрежденной эндотелиальной монослоя раковых клеток 6. Эти анализы, как правило, не имеют гидродинамику и факторы стромы, которые бы в противном случае повлиять на прикрепление клеток рака к эндотелиальной стенке. Этот вопрос несколько обойдена perfusable сосудистых сетей , которые возникают из 3D культуры эндотелий с поддержкой стромальных клеток, и эти 3D микрофлюидальные системы в настоящее время представляют передовые позиции существующих в пробирке вариантов 7,8. Тем не менее, эти подходы не указывать надежный микросреду функциональной системы кровообращенияи , следовательно , только в части замены для моделей в естественных условиях.
Наиболее широкое применение в естественных условиях модели сосудистой инвазии является мышь, в которой экспериментальные метастазирование анализы обычно выполняются , так как они происходят на относительно коротком временном масштабе и , как правило , свидетельствуют о метастатической способности 9. Эти анализы включают прямой инъекции раковых клеток в оборот и, следовательно, моделировать конечные стадии метастазирования, а именно транссудации и раковых клеток колонизации органов. Экспериментальные метастазирование анализы различаются в зависимости от места инъекции раковых клеток и органов, в конечном счете проанализированы. В первом типе анализа, раковые клетки инъецируют в хвостовую вену мышей и клеток рака посевом в легких контролируется 10,11. Второй анализ включает проведение внутрисердечной инъекции , чтобы направить метастатический высев по направлению к кости микроокружения 12-14, но и мозг 15. В третьем исследовании, рак Cгезов впрыскивают в селезенке, чтобы позволить колонизация печени 16 , тогда как четвертый путь доставки в сонную артерию несет раковые клетки головного мозга 17,18. Независимо от способа доставки раковых клеток, колонизация орган является признанной экспериментальной конечной точки и, как правило, определяется с помощью люминесценции, гистологии, или методов на основе ПЦР. Несмотря на физиологические преимущества проведения экспериментальных анализов метастазов в мышиной хозяина, эти эксперименты все еще требуют недель до нескольких месяцев, чтобы завершить и анализировать.
Данио модель (Danio rerio) недавно стала новой системы для изучения прогрессии рака 19,20, и позволяет для оценки раковых клеток сосудистой инвазии в пределах функциональной системы кровообращения за гораздо более короткие сроки по сравнению с мышами 21-24. Метод использует прозрачный данио штамм, который имеет свою эндотелий маркированный с зеленым коралловых рифов флуофлуоресцентным белком репортер под контролем промотора kdrl, данио рецептора фактора роста сосудистого эндотелия 25. В анализе, раковые клетки помечены красным флуоресцентным маркером и вводят в precardiac пазухи 2-дневных эмбрионов. Где-то между 48 до 96 ч после инъекции, раковые клетки, которые захватившие из сосудистую сеть и в хвостовую область эмбрионов может быть забит эффективно на флуоресцентный микроскоп. Здесь мы применяем технику к панели обычно используемых линий клеток рака молочной железы человека, чтобы продемонстрировать сильнейшие различия в их сосудистой инвазивной способности. Более того, мы показали, что изменение места инъекции в эмбрион желтка позволяет для изучения гетерогенных взаимодействий клеток, в популяции раковых клеток может быть дифференциально меченные флуоресцентными красителями и вводили в эмбрионов данио рерио, не имеющих флуоресцентный сосудистую сеть. В этом последнем исследовании, раковые клетки, которые наводнили желток и intravasated в vasculaturе засчитываются в каудальной области от 24 до 48 ч после инъекции. Благодаря эффективности и удобства данной модели данио все чаще используют для быстрого тестирования сосудистой инвазивной способность раковых клеток при физиологическом обстановке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод использует данио модель для эффективного тестирования сосудистую инвазивные способность раковых клеток (рисунок 1). Здесь мы применили технику к панели клеток рака молочной железы линии , с тем , чтобы обеспечить базовый уровень , на которую другие исследователи мог…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d’Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -. N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , (2016).
