Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
1880 1 में मानव में और Sandstrom द्वारा कई अन्य प्रजातियों में parathyroid ग्रंथियों के पहले व्यवस्थित वर्णन है, मानव शरीर विज्ञान और रोग के लिए इस छोटे से अंत: स्रावी अंग के महत्व को समझने के बाद से लगातार सुधार हुआ है। Parathyroid ग्रंथियों पैराथायराइड हार्मोन (PTH), कैल्शियम चयापचय के प्रिंसिपल नियामक छिपाना। PTH भी फॉस्फेट homeostasis और हड्डी कारोबार 1, 2 के लिए एक महत्वपूर्ण हार्मोन है। गर्दन की सर्जरी के दौरान आकस्मिक हटाने या parathyroids की क्षति hypoparathyroidism का सबसे आम कारण, एक बीमारी कम रक्त कैल्शियम, कम PTH, और ऊंचा फास्फोरस 1 के द्वारा होती है।
बेहतर अध्ययन करने के लिए और परीक्षण hypoparathyroidism उपन्यास चिकित्सा, विश्वसनीय और आसानी से सुलभ माउस मॉडल के लिए आवश्यक हैं हासिल कर ली। चूहे व्यापक रूप से अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है क्योंकि आनुवंशिक उपकरणों की एक विस्तृत विविधता एक हैंइस प्रजाति विवो में परिष्कृत यंत्रवत अध्ययनों की अनुमति देने में vailable। हालांकि, जबकि शल्य parathyroidectomy (PTX) चूहों 2, 3, 4, 5, और बड़े स्तनधारियों 6, 7, 8 में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह तकनीकी रूप से ग्रंथियों के छोटे आकार और उनके चर शारीरिक वितरण की वजह से चूहों में बहुत ही चुनौतीपूर्ण है 9। इसलिए, Thyro-parathyroidectomy (TPTX) आम तौर पर चूहों, जिसमें थायराइड और parathyroid ग्रंथियों एक साथ 10 को हटा रहे हैं में किया जाता है। हालांकि, कम थायराइड हार्मोन के स्तर प्रयोगों में एक संभावित confounder, इस मॉडल उलझी हैं। इसके अलावा, थायराइड ग्रंथि के भीतर सी कोशिकाओं है, जो कैल्सीटोनिन, कृन्तकों में एक हार्मोन कैल्शियम homeostasis में महत्वपूर्ण है, का उत्पादन भी वीं के हटाने पर खो रहे हैंyroids 11।
Hypoparathyroidism के कई आनुवंशिक माउस मॉडल मौजूद हैं, जो PTH-अशक्त माउस 12, GCM2 अशक्त माउस 13, और कैल्शियम संवेदन रिसेप्टर (CaSR) 14, 15 में एक सक्रिय उत्परिवर्तन के साथ Nuf माउस शामिल हैं। हालांकि, इन आनुवंशिक दोषों को पहले से ही भ्रूण के विकास के दौरान मौजूद हैं, और parathyroids के समारोह इसलिए पहले से ही embryogenesis दौरान बिगड़ा हुआ है। इस तरह के कंकाल के रूप में अंगों के विकास को प्रभावित कर सकते हैं। यह जो बीमारी के बाद के जीवन में प्राप्त postsurgical hypoparathyroidism के साथ रोगियों के साथ विरोधाभासों। इसके अलावा, इन माउस मॉडल में से कुछ जल्दी मारक और प्रजनन क्षमता में कमी है, जो आगे उनके उपयोग 12, 13, 14 पेचीदा दिखा रहे हैं।
हम दो नए माउस मीटर विकसितका अधिग्रहण hypoparathyroidism के लिए odels। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर है कि चूहों व्यक्त GFP विशेष parathyroids में थायराइड ग्रंथि को हटाने के बिना parathyroid ग्रंथियों आसानी से शल्य हटाने के लिए पहचान करने की अनुमति देता का उपयोग करना। इस माउस PTH-CRE माउस, जो रोजा mTmG माउस के साथ 5.5 केबी PTH प्रमोटर 16 के नियंत्रण में Cre recombinase व्यक्त पार करके तैयार की गई थी। जिसके परिणामस्वरूप PTHcre; mTmG चूहों parathyroid कोशिकाओं में विशेष रूप से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं। दूसरी माउस मॉडल ही PTH-CRE, एक बंद कैसेट parathyroids में विशेष रूप से डिप्थीरिया विष रिसेप्टर की अभिव्यक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप inducible डीटीआर माउस से दूर करने के लिए, इस समय का उपयोग करता है। डीटी के प्रणालीगत प्रशासन parathyroid कोशिकाओं को नष्ट कर, प्रतिपादन जानवरों सर्जरी के बिना hypoparathyroid।
दो माउस इस अध्ययन में प्रस्तुत मॉडलों तीन महीने अवलोकन पेरी में एक स्थिर hypocalcemic phenotype प्रदर्शितआयुध डिपो। प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, फेनोटाइप प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और hypoparathyroid चूहों एक उच्च जीवित रहने की दर 17 दिखा रहे हैं।
हम parathyroid ग्रंथियों में GFP अभिव्यक्ति चुनिंदा साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग GFP-निर्देशित parathyroidectomy की तकनीक का प्रदर्शन। PTHcre में; mTmG चूहों, डबल प्रतिदीप्ति (सीआरई व्यक्त कोशिकाओं और गैर-Cre में लाल टमाटर में हरी GFP कोशिकाओं में व्यक्त) हमें सक्षम स्पष्ट रूप से पहचान करने के लिए, और ठीक thyroids हटाने के बिना सभी parathyroid ग्रंथियों को हटाने के लिए। हम फ्लोरोसेंट लाल गैर parathyroid ऊतक पहचान करने की क्षमता के लिए डबल प्रतिदीप्ति mTmG चूहों का उपयोग पसंद करते हैं, हमारे प्रक्रिया भी अच्छी तरह से एक फ्लोरोसेंट जानवरों का उपयोग इस तरह टमाटर लाल (B6.Cg सीटी (रोजा) 26Sortm14 (के रूप में काम करना चाहिए कैग-tdTomato) Hze / जम्मू) माउस। प्रक्रिया, प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है माउस प्रति के बारे में 20 मिनट की आवश्यकता है, और एक गंभीर और निरंतर hypoparathyroid phenotype में परिणाम है।
इसके अलावा, GFP पॉजिटिव parathyroid ग्रंथियों का एक अन्य लाभ न्यायपालिका parathyroid ग्रंथियों का पता लगाने में आसानी है। हमारे अध्ययन का प्रदर्शनबी -6 चूहों (चित्रा 1), जो आसानी से हरे रंग की रोशनी से हमारे माउस मॉडल में पता चला रहे हैं के बारे में एक तिमाही में parathyroids की mislocalization। Thyro-parathyroidectomy के विपरीत, हमारी तकनीक थायराइड हार्मोन रिप्लेसमेंट और कैल्सीटोनिन उत्पादक थायराइड सी कोशिकाओं को हटाने के अज्ञात प्रभाव के लिए बाद में आवश्यकता के साथ थायराइड के हटाने से बचा जाता है। Fluorescently लेबल parathyroid ग्रंथियों भी अन्य जांच कि parathyroid ग्रंथियों के अलगाव की आवश्यकता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मॉडल की सीमा सर्जरी के लिए आवश्यकता भी शामिल है। बेसिक microsurgery कौशल और एक फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत के साथ एक विच्छेदन खुर्दबीन के लिए आवश्यक हैं।
कि शल्य चिकित्सा के लिए की आवश्यकता समाप्त hypoparathyroid चूहों पैदा करने के लिए एक दूसरी तकनीक का प्रदर्शन किया है। डिप्थीरिया विष का इलाज PTHcre-आई डी टी आर चूहों एक मामूली hypoparathyroidism phenotype दिखा रहे हैं, लेकिन बस माउस में intraperitoneally डीटी इंजेक्शन लगाने की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण हिस्सा foआर इस मॉडल था खुराक के अनुकूलन पैदा करने और आहार खुराक। डीटी की उच्च खुराक विषाक्तता के लिए नेतृत्व किया है, लेकिन कम मात्रा दृष्टिकोण की प्रभावकारिता की कमी हुई। हम निर्धारित किया है कि 5 माइक्रोग्राम / किलो, प्रशासित पर 2 इंजेक्शन की खुराक रेजिमेंट 3 दिन के अलावा, कोई / न्यूनतम मृत्यु दर के साथ विश्वसनीय और स्थिर hypocalcemia में हुई।
अंत में, हमें उम्मीद है कि इन दो दृष्टिकोणों का अधिग्रहण hypoparathyroidism के लिए उपयोगी माउस मॉडल प्रदान करते हैं। एक उपन्यास लंबे समय से अभिनय PTH उपयोग करना, हम hypoparathyroidism 17 के लिए नई दवाओं की प्रभावकारिता का निर्धारण करने में इन मॉडलों के दोनों का इस्तेमाल पहली बार सूचना दी।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया अनुदान मौखिक रोगों ओपन अनुदान SKLOD2015OF01 (आरबी) के R01-DK100584 और चीन के राज्य कुंजी प्रयोगशाला। हम मदद के लिए Wenping झाओ, Tadatoshi सातो, और केली लौटर धन्यवाद।
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |