Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Depuis la première description systématique des glandes parathyroïdes chez l' homme et dans plusieurs autres espèces par Sandström en 1880 1, la compréhension de l'importance de ce petit organe endocrine pour la physiologie humaine et la maladie a continuellement amélioré. glandes parathyroïdes sécrètent l'hormone parathyroïdienne (PTH), le principal régulateur de métabolisme du calcium. PTH est également une hormone importante pour l' homéostasie du phosphate et du remodelage osseux 1, 2. Suppression accidentelle ou d' endommagement des parathyroïdes lors de la chirurgie du cou est la cause la plus fréquente de l' hypoparathyroïdie, une maladie caractérisée par une faible taux de calcium sanguin, faible PTH, et de phosphore élevées 1.
Pour mieux étudier acquis hypoparathyroïdie et de test de nouvelles thérapies, fiable et facilement des modèles de souris accessibles sont nécessaires. Les souris sont largement utilisés dans la recherche, car une grande variété d'outils génétiques sont unvailable dans cette espèce permettant des études mécanistiques sophistiquées in vivo. Cependant, alors que parathyroidectomie chirurgical (PTX) peut être utilisé chez les rats 2, 3, 4, 5, et les grands mammifères 6, 7, 8, il est techniquement très difficile chez la souris en raison de la petite taille des glandes et leur répartition anatomique variables 9. Par conséquent, thyro-parathyroïdectomie (TPTX) est généralement effectuée chez la souris, dans laquelle la thyroïde et les glandes parathyroïdes sont enlevés ensemble 10. Cependant, les niveaux d'hormones thyroïdiennes faibles sont un facteur de confusion potentiel dans des expériences, ce qui complique ce modèle. En outre, les cellules C au sein de la glande thyroïde, qui produisent de la calcitonine, une hormone importante dans l'homéostasie du calcium chez les rongeurs, sont également perdues lors du retrait de la ièmeyroids 11.
Plusieurs modèles de souris génétiques de l' hypoparathyroïdie existent, qui comprennent la souris PTH-12 null, la GCM2 nulle souris 13 et la souris Nuf avec une mutation activatrice du récepteur sensible au calcium (CaSR) 14, 15. Cependant, ces anomalies génétiques sont déjà présents au cours du développement embryonnaire, et la fonction des parathyroïdes est donc déjà altérée au cours de l'embryogenèse. Ceci peut affecter le développement des organes tels que le squelette. Cela contraste avec les patients avec hypoparathyroïdie postopératoires qui acquièrent la maladie plus tard dans la vie. En outre, certains de ces modèles de souris présentent une létalité précoce et une fertilité réduite, ce qui complique davantage leur utilisation 12, 13, 14.
Nous avons développé deux nouveaux m de la sourisodèles pour hypoparathyroïdie acquise. En utilisant des souris transgéniques qui expriment la GFP spécifiquement dans les glandes parathyroïdes permet parathyroïdes d'être facilement identifiés pour l'ablation chirurgicale sans enlever la glande thyroïde. Cette souris a été générée par croisement de souris Cre-PTH, qui exprime la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur de 5,5 kb PTH 16 avec la souris ROSA MTMG. Les PTHcre résultant; souris MTMG expriment la protéine fluorescente verte spécifiquement dans les cellules parathyroïdes. Le second modèle de souris utilise le même PTH-Cre, cette fois pour retirer une cassette d'arrêt de la souris DTR inductible, ayant pour résultat l'expression du récepteur de la toxine diphtérique spécifiquement dans les glandes parathyroïdes. L'administration systémique de DT détruit les cellules parathyroïdes, ce qui rend les animaux hypoparathyroid sans chirurgie.
Les deux modèles de souris présentés dans cette étude démontrent un phénotype hypocalcémiant stable au cours des péri d'observation de trois moisod. Les procédures sont faciles à réaliser, le phénotype est reproductible, et les souris hypoparathyroid présentent un taux 17 de survie élevé.
Nous démontrons la technique de parathyroïdectomie GFP-guidée en utilisant des souris transgéniques avec expression de la GFP sélectivement dans les glandes parathyroïdes. Dans les PTHcre; souris MTMG, la double fluorescence (la GFP verte dans les cellules Cre-exprimés et rouge tomate dans la non-Cre cellules exprimé) nous a permis d'identifier clairement, et d'éliminer précisément toutes les glandes parathyroïdes sans enlever les thyroïdes. Alors que nous préférons l'utilisation de la double-fluorescence des souris MTMG pour la capacité d'identifier les tissus non-parathyroïdienne rouge fluorescent, notre procédure devrait aussi bien fonctionner en utilisant des animaux fluorescents simples tels que le rouge de la tomate (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) souris. La procédure est relativement facile à réaliser, nécessite environ 20 min par souris, et se traduit par un phénotype sévère hypoparathyroid et durable.
En outre, un autre avantage des glandes parathyroïdes positives à GFP est la facilité de détection des glandes parathyroïdes aberrantes. Nos études démontrentmauvaise localisation des parathyroïdes dans environ un quart des souris B6 (Figure 1), qui sont facilement détectés dans notre modèle de souris par la fluorescence verte. Contrairement à ce que thyro-parathyroidectomie, notre technique évite le retrait de la thyroïde avec un besoin ultérieur pour le remplacement de l'hormone de la thyroïde et de l'effet connu de la suppression de cellules C thyroïdiennes calcitonine productrices. parathyroïdes marquées par fluorescence peuvent aussi être utilisés pour d'autres investigations qui nécessitent l'isolement des glandes parathyroïdes. La limitation de ce modèle comprend l'exigence d'une intervention chirurgicale. compétences de microchirurgie de base et d'un microscope de dissection avec une source de lumière fluorescente sont nécessaires.
Une seconde technique pour générer des souris hypoparathyroid qui élimine la nécessité d'une intervention chirurgicale est mise en évidence. Toxine diphtérique-souris traitées PTHcre-IDTR présentent une hypoparathyroïdie phénotype plus doux, mais exigent simplement injecter DT par voie intrapéritonéale à la souris. La partie critique for génère ce modèle a été l'optimisation de la dose et le régime posologique. Des doses élevées de DT ont conduit à la toxicité, mais de faibles doses ont diminué l'efficacité de l'approche. Nous avons déterminé que le régiment de dose de 2 injections à 5 ug / kg, administrée 3 jours d'intervalle, a donné lieu à une hypocalcémie fiable et stable sans mortalité / minimal.
En fin de compte, nous espérons que ces deux approches offrent des modèles de souris utiles pour hypoparathyroïdie acquise. L' utilisation d' un roman PTH longue durée d'action, nous avons rapporté la première utilisation de ces deux modèles pour déterminer l'efficacité de nouveaux médicaments pour hypoparathyroïdie 17.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le NIH accorde R01-DK100584 et China State Key Laboratory de maladies bucco-de SKLOD2015OF01 de financement ouvert (RB). Nous remercions Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, et Kelly Lauter aide.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |