Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
מאז התיאור השיטתי הראשון של בלוטת יותרת התריס ב אדם בכמה מינים אחרים על ידי Sandström בשנת 1880 1, הבין את המשמעות של איבר האנדוקרינית הקטן הזו עבור פיזיולוגיה אנושית ומחלות השתפר ברציפות. בלוטות יותרת התריס להפריש הורמון יותרת התריס (PTH), הרגולטור העיקרי של משק הסידן. PTH הוא גם הורמון חשוב עבור הומאוסטזיס פוספט ועצמות מחזור 1, 2. סרה או ניזק מקרי של parathyroids במהלך ניתוח צוואר הוא הגורם השכיח ביותר של היפופרתירואידיזם, מחלה המאופיינת סידן נמוך בדם, PTH הנמוך, וזרחן גבוהה 1.
ללמוד טוב יותר רכש היפופרתירואידיזם וטיפולי רומן בדיקה, אמין ומודלי עכבר ונגישים נדרשים. עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר כי מגוון רחב של כלים גנטיים הואvailable במינים זו המתירה מחקרים מכניסטית מתוחכמים in vivo. עם זאת, בעוד parathyroidectomy כירורגית (PTX) ניתן להשתמש בחולדות 2, 3, 4, 5, ו גדול יונק 6, 7, 8, מהבחינה טכנית היא מאוד מאתגרת בעכברים בגלל גודלו הקטן של הבלוטות והפצת אנטומי משתנית שלהם 9. לכן, thyro-parathyroidectomy (TPTX) מבוצעת בדרך כלל בעכברים, שבו התריס בלוטת יותרת התריס יוסרו יחד 10. עם זאת, רמות הורמון בלוטת תריס נמוכות הם מתערבים פוטנציאל בניסויים, שמסבכים את המודל הזה. בנוסף, C-תאים בתוך בלוטת התריס, אשר מייצרים קלציטונין, הורמון חשוב הומאוסטזיס סידן במכרסמים, הם איבדו גם עם הסרת הyroids 11.
במודלים של עכברים גנטיים כמה היפופרתירואידיזם להתקיים, הכוללים את עכבר null-PTH 12, עכבר-null GCM2 13, ועכבר Nuf עם מוטציה הפעלה במבנה הקולטן חישת סידן (CaSR) 14, 15. עם זאת, פגמים הגנטיים אלה כבר נמצאים במהלך התפתחות עוברית, והפונקציה של parathyroids לכן כבר לקויה במהלך embryogenesis. זה יכול להשפיע על התפתחות איברים כמו שלד. זאת לעומת חולים עם היפופרתירואידיזם לאחר ניתוח שרוכשים המחלה בשלב מאוחר יותר בחיים. יתר על כן, חלק במודלים של עכברים אלה מפגינים קטלניים מוקדם בפוריות, אשר מסבכת עוד יותר את השימוש בם 12, 13, 14.
פתחנו שני מטר עכבר חדשodels עבור היפופרתירואידיזם רכש. שימוש בעכברים מהונדסים גנטית המבטאים GFP דווקא parathyroids מאפשר בלוטת יותרת התריס להיות מזוהה בקלות על הסרה כירורגית מבלי להסיר את בלוטת התריס. העכבר הזה נוצר על ידי חציית העכבר PTH-Cre, המבטא Cre recombinase תחת שליטה של האמרגן 5.5 kb PTH 16 עם העכבר ROSA mTmG. PTHcre וכתוצאה מכך; עכברים mTmG לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק במיוחד בתאים יותרת התריס. מודל העכבר השני משתמש באותו PTH-Cre, הפעם כדי להסיר קלטת STOP מעכבר DTR המושרה, וכתוצאה מכך הביטוי של הקולטן רעלן דיפתריה דווקא parathyroids. ממשל מערכתי של DT הורס תאי יותרת תריס, טיוח החיות hypoparathyroid ללא ניתוח.
שני מודלי העכבר המוצגים במחקר זה להפגין פנוטיפ hypocalcemic יציב לאורך פרי התצפית של שלושה חודשיםod. הנהלים מהווים קלים לביצוע, פנוטיפ ניתנת לשחזור, ועכברי hypoparathyroid מפגינים שיעור הישרדות גבוה 17.
אנו מדגימים את הטכניקה של parathyroidectomy GFP-מודרך באמצעות עכברים מהונדסים עם ביטוי של GFP סלקטיבי בלוטת יותרת התריס. בשנתי ה PTHcre; עכברי mTmG, הקרינה הכפולה (ה- GFP הירוק בתאים הביעו Cre בניות אדומות הלא-Cre הביע תאים) אפשרה לנו לזהות בבירור, וכדי להסיר כל בלוטת יותרת התריס בדיוק מבלי להסיר את התריס. למרות שאנו מעדיפים את השימוש של עכברי פעמי קרינת mTmG על היכולת לזהות רקמות שאינן יותרת תריס אדום ניאון, ההליך שלנו צריך גם לעבוד גם באמצעות חיות פלורסנט יחידות כגון אדום העגבני (B6.Cg-CT (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) העכבר. ההליך הוא יחסית קל לבצע, דורש כ 20 דקות לכל עכבר, והתוצאות פנוטיפ hypoparathyroid חמורה ומתמשכת.
בנוסף, יתרון נוסף של בלוטת יותרת התריס GFP חיובי הוא הקלות של זיהוי של בלוטת יותרת התריס סוטה. המחקרים שלנו להפגיןmislocalization של parathyroids ב כרבע עכברים B6 (איור 1), אשר מזוהים בקלות במודל העכבר שלנו על ידי פלואורסצנטי ירוק. בניגוד thyro-parathyroidectomy, הטכניקה שלנו תמנע את הסרת בלוטת התריס עם צורך עוקב עבור החלפת הורמון בלוטת תריס ואת האפקט לא הידוע של הסרת תאי C קלציטונין לייצור תריס. Fluorescently שכותרתו בלוטת יותרת התריס יכול לשמש גם עבור חקירות אחרות שדורשות את בידודה של בלוטת יותרת התריס. המגבלה של מודל זה כולל את הדרישה לניתוח. מיומנויות המיקרו-כירורגיה בסיסי מיקרוסקופ לנתיחה עם מקור אור ניאון נדרשים.
טכניקה שנייה ליצירת עכברי hypoparathyroid זה מבטל את הצורך בניתוח מודגמת. דיפטריה רעלן שטופל עכברי PTHcre-iDTR תערוכת פנוטיפ היפופרתירואידיזם מתון, אבל פשוט דורשים הזרקת DT intraperitoneally לתוך העכבר. החלק הקריטי FOr יצירת מודל זה היה אופטימיזציה של מינון ומינון משטר. מינונים גבוהים של DT הובילו רעילות אך במינונים נמוכים ירדו את היעילות של הגישה. קבענו כי הגדוד מנה של 2 זריקות ב 5 מיקרוגרם / ק"ג, מנוהל בנפרד 3 ימים, הביא היפוקלצמיה אמין ויציב ללא / תמותה מינימלית.
בסופו של דבר, אנו מקווים כי שתי גישות אלה מספקים במודלים של עכברים שימושיים היפופרתירואידיזם רכש. באמצעות PTH ארוך טווח רומן, דיווחנו השימוש הראשון של שני המודלים האלה בקביעת היעילות של תרופות חדשות היפופרתירואידיזם 17.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R01-DK100584 וסין מדינת מפתח מעבדה של מחלות הפה SKLOD2015OF01 מימון פתוח (RB). אנו מודים Wenping זאו, Tadatoshi סאטו, וקלי לאוטר לעזרה.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |