Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Siden den første systematisk beskrivelse av biskjoldkjertlene i mennesker og i flere andre arter av Sandström i 1880 en, forstå betydningen av denne lille endokrine organ for menneskets fysiologi og sykdoms har kontinuerlig forbedret. Parathyroid kjertler skiller parathyreoideahormon (PTH), rektor regulator av kalsium metabolisme. PTH er også et viktig hormon for fosfat homeostase og benomsetning 1, 2. Utilsiktet fjerning eller skade av parathyroids under halskirurgi er den vanligste årsaken til hypoparathyroidism, en sykdom preget av lav blod kalsium, lav PTH, og forhøyede fosfor 1.
Å bedre studie kjøpt hypoparathyroidism og teste nye behandlingsformer, pålitelig og lett tilgjengelige musemodeller er påkrevd. Mus som er mye brukt i forskning, fordi en rekke genetiske verktøy er enTilg hos denne arten tillater sofistikerte mekanistiske studier in vivo. Men mens kirurgisk paratyreoidektomi (PTX) kan brukes i rotter 2, 3, 4, 5 og større pattedyr 6, 7, 8, er det teknisk meget krevende i mus på grunn av den lille størrelsen av kjertler og deres variable anatomisk fordeling 9. Derfor er thyro-paratyreoidektomi (TPTX) vanligvis utført på mus, der skjoldbruskkjertelen og parathyroid kjertler fjernes sammen 10. Men lave skjoldbrusk hormon nivåene er en potensiell confounder i eksperimenter, kompliserer denne modellen. I tillegg er C-celler i skjoldbruskkjertelen, som produserer kalsitonin, et hormon viktig i kalsiumhomeostase hos gnagere, også tapt i forbindelse med fjerning av thyroids 11.
Flere genetiske musemodeller av hypoparathyroidism eksisterer, som inkluderer PTH-null mus 12, den GCM2-null mus 13, og Nuf mus med en aktiverende mutasjon i kalsium-sensing reseptor (CaSR) 14, 15. Men disse genetiske defekter allerede er til stede under embryonal utvikling og funksjon av parathyroids derfor allerede er svekket i løpet av embryogenesen. Dette kan påvirke utviklingen av organer som skjelett. Dette i motsetning til pasienter med postsurgical hypoparathyroidism som erverver sykdommen senere i livet. Dessuten har enkelte av disse musemodeller utviser tidlig dødelighet og redusert fertilitet, noe som ytterligere kompliserer deres bruk 12, 13, 14.
Vi har utviklet to nye mus models for ervervet hypoparathyroidism. Ved hjelp av genmodifiserte mus som uttrykker GFP spesielt i parathyroids gjør biskjoldkjertlene å bli lett identifiseres for kirurgisk fjerning uten å fjerne skjoldbruskkjertelen. Denne mus ble generert ved passering av PTH-Cre mus som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av den 5,5 kb PTH-promoteren 16 med ROSA mTmG mus. De resulterende PTHcre; mTmG mus uttrykker grønt fluorescerende protein spesifikt i parathyroid celler. Den andre musemodell benytter den samme PTH-Cre, denne gang for å fjerne en STOP-kassetten fra den induserbare DTR mus, noe som resulterer i ekspresjon av difteri-toksin-reseptoren spesifikt i de parathyroids. Systemisk administrasjon av DT ødelegger parathyroid celler, gjengi dyrene hypoparathyroid uten kirurgi.
De to musemodeller som presenteres i denne studien viser en stabil hypokalsemisk fenotype over tremåneders observasjons period. Prosedyrene er enkle å utføre, er fenotype reproduserbar, og hypoparathyroid mus viser en høy overlevelse 17.
Vi demonstrerer teknikken av GFP-guidet paratyreoidektomi bruker transgene mus med GFP uttrykk selektivt i biskjoldkjertlene. I PTHcre, mTmG mus, dobbel fluorescens (den grønne GFP i Cre-uttrykt celler og rød tomat i ikke-Cre uttrykt celler) gjort oss i stand til å identifisere og presist fjerne alle biskjoldkjertlene uten å fjerne thyroids. Selv om vi foretrekker å bruke den doble fluorescens mTmG mus for evnen til å identifisere fluorescerende røde non-parathyroid vev, bør vår prosedyre også fungere godt ved hjelp av enkle fluorescerende dyr som tomat rød (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mus. Fremgangsmåten er relativt enkel å utføre, krever omtrent 20 min per mus, og resulterer i en alvorlig og vedvarende hypoparathyroid fenotype.
I tillegg er en annen fordel av GFP-positive biskjoldkjertlene er den enkle påvisning av avvikende biskjoldkjertlene. Våre studier visermislocalization av parathyroids i omtrent en fjerdedel av B6-mus (figur 1), som er lett oppdages i vår musemodell av den grønne fluorescens. I motsetning til thyro-paratyreoidektomi, unngår vår teknikk fjerning av skjoldbruskkjertelen med påfølgende behov for skjoldbruskkjertelhormon og den ukjente effekten av fjerning av calcitonin-produserende thyroid C-celler. Fluorescensmerkede biskjoldkjertlene kan også anvendes for andre undersøkelser som krever isolering av biskjoldkjertlene. Begrensningen av denne modellen inkluderer kravet om kirurgi. Grunnleggende mikrokirurgi ferdigheter og en disseksjon mikroskop med et fluorescerende lyskilde er påkrevd.
En annen teknikk for å generere hypoparathyroid mus som eliminerer behovet for kirurgi er demonstrert. Difteri toksin-behandlede PTHcre-IDTR mus viser en mildere hypoparathyroidism fenotype, men bare trenger å injisere DT intraperitonealt i musen. Den kritiske delen for generere denne modellen ble optimalisering av dosering og doseringsregime. Høye doser av DT førte til toksisitet, men lave doser reduserte effekten av tilnærmingen. Vi bestemte at dosen regiment av 2 injeksjoner på 5 mikrogram / kg, administrert 3 dager fra hverandre, førte pålitelig og stabil hypokalsemi med ingen / minimal dødelighet.
Til syvende og sist, håper vi at disse to tilnærmingene gi nyttige musemodeller for ervervet hypoparathyroidism. Ved hjelp av en ny langtidsvirkende PTH, rapporterte vi den første bruk av begge disse modellene i å bestemme effekten av nye legemidler for hypoparathyroidism 17.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01-DK100584 og China State Key Laboratory av orale sykdommer Åpne Funding SKLOD2015OF01 (RB). Vi takker Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, og Kelly Lauter om hjelp.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |