Levitação magnética Juntamente com imagem Portátil e Análise para a doença Diagnostics

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

Aqui, apresentamos uma plataforma tecnológica e uma técnica que utiliza levitação magnética juntamente com imagiologia e análise automatizada para analisar a distribuição da densidade de células de um paciente como um indicador para a doença. Esta abordagem versátil para análise de citometria de densidade baseada em última instância pode ser aplicado a uma gama de diagnóstico de doenças. No entanto, a fim de ser compatível com os testes point-of-care e uso em países em desenvolvimento, a técnica deve satisfazer os requisitos de baixo custo, portabilidade e facilidade de uso. O dispositivo e consumíveis deve ser facilmente obtidos a um custo baixo. A preparação da amostra deve ser simples, a análise deve ser automatizada com os requisitos mínimos para entrada do usuário ou interpretação, e os resultados devem ser devolvidos rapidamente. Além disso, o dispositivo deve ser compacto e portátil para ser útil em ambientes clínicos, bem como os países em desenvolvimento. Assim, desenvolvemos um dispositivo e método para usar levitação magnética no ponto de atendimento compatível com tecnogia por análise de imagem e imagem de acoplamento automatizado para retornar os resultados sobre a distribuição de densidade de uma população de células de um paciente.

tecnologias de ponto de cuidados oferecem uma vantagem notável sobre procedimentos de testes laboratoriais clínicos atuais. A tecnologia disponível atualmente é muito caro para ser possuído por um clínico ou demasiado complexo para ser realizada por pessoal médico. Muitos desses procedimentos exigem protocolos de trabalho intensivo que deve ser realizado por um técnico treinado. Por estas razões, as amostras dos doentes, tais como sangue ou urina são geralmente recolhidas no consultório do médico, em seguida, transferidas para um laboratório remota e centralizada de teste para testes clínicos, o que pode levar vários dias para o médico para receber os resultados do teste. Isto pode causar atrasos ou complicações no decurso do tratamento em alguns casos, faz com que este teste muito dispendioso e ineficiente (causando um encargo financeiro para os contribuintes de seguros), e faz com que muitos maisdiagnósticos de difícil acesso em ambientes de baixa renda e países em desenvolvimento.

Aqui, nós apresentamos uma técnica de levitação magnética acoplada com imagem automatizada e análise em ambos com um dispositivo de imagem incorporado e processamento (Figura 1) e um dispositivo de aparelho compatível (Figura 2). Estes dispositivos à base de levitação magnética representam uma tecnologia de plataforma amplamente aplicável, que tem o potencial de ser aplicado a uma variedade de diferentes aplicações de diagnóstico médico. As funções de abordagem de levitação magnética baseado num equilíbrio entre duas forças: uma força magnética e uma força de flutuação ^{1, 2, 3.} Quando uma partícula é suspenso num meio paramagnético e inserido num campo magnético gerado por dois ímans com pólos como viradas uma para a outra, uma atos força magnética sobre as partículas na direcção para a linha central entre os dois magn ets. A força da impulsão é causada pela densidade relativa da partícula em relação ao meio de suspensão e é ascendente, no caso de partículas menos densas do que o meio e para baixo no caso de partículas mais densas do que o meio circundante. Com base nestas duas forças, as partículas vão chegar a uma posição de equilíbrio do campo de levitação em que equilibra estas duas forças; esta posição está directamente relacionada com a densidade da partícula, com as partículas mais densas levitação menor no campo do que as partículas menos densas. Um módulo de imagem, quer uma câmara integrada aparelho ^{4, 5, 6} ou componentes ópticos independentes equipado com uma lente de ampliação ^{de 7, 8,} são utilizadas para visualizar as posições das partículas. Processamento de imagem, quer através de um aplicativo de smartphone ^{4, 5,}= "refex"> 6 ou uma unidade de processamento embebido ^{7, 8,} em seguida, processa as imagens capturadas para quantificar a distribuição espacial e, por conseguinte, a distribuição da densidade da população. A fim de analisar as amostras maiores (tais como aqueles com apenas algumas partículas de interesse por mililitro, o fluxo pode ser integrado directamente no dispositivo tal que as partículas são levitado e analisadas à medida que passam através da região de imagem (Figura 2).

Figura 1: Auto-contido Plataforma levitação magnética. (A) dispositivo de levitação magnética compactos, incluindo um módulo magnético focagem, componentes de imagem (um díodo emissor de luz (LED), uma lente óptica, e um detector de câmara), e uma unidade de processamento com um ecrã de visualização. (B) a força do campo magnético no croSS-secção da área entre os ímans que se insere a amostra. A intensidade do campo é maior na superfície dos ímans e se aproxima de zero na linha central entre eles. (C) As partículas, tais como células, dentro da experiência de campo magnético várias forças: a força magnética (F _m) para a linha central entre os magnetos, com magnitude variando com base na posição da partícula; uma força gravitacional (F _G ') que depende da densidade das partículas em relação à do meio de suspensão, e uma força de arrastamento (f _d) resistindo ao movimento das partículas. Reproduzido, com permissão, de Yenilmez, et al. ⁸ Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

FIGure 2: Smartphone compatível Flow-assistida Plataforma levitação magnética. (A – c) Frontal (a), lateral (b), e de volta (c) pontos de vista de dispositivo magnético de levitação (d) Os componentes do dispositivo incluem: 1) módulo de levitação magnética, incluindo ímãs permanentes, uma lente de aumento e um difusor LED e luz, 2) caso do smartphone, 3) eletrônica, incluindo um microcontrolador, controlador da bomba, e um receptor Bluetooth, 4) titular micro-bomba, 5) orifício ajustável, 6) suporte de tubos de resíduos, 7) suporte da bateria, 8 ) suporte de amostras, 9) suporte dual-purpose e cobertura. (E) fluxo esquemático, que mostra o bombeamento da amostra através do campo magnético. (F) Secção transversal do módulo de levitação magnética, que mostra como as partículas de diferentes densidades irá alinhar como eles são bombeados através do campo; menos partículas densas, como a partícula 1, irá equilibrar-se a um maior levitação altura than partículas mais densas, como a partícula 2. Reproduzido, com permissão, de Amin, et al. ¹ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os requisitos mínimos para o uso de qualquer amostra para análise da distribuição de densidade neste sistema incluem a capacidade para se obter uma suspensão de células ou partículas maiores do que cerca de 5 um e menos do que cerca de 250 um em tamanho (para imagens e processamento de imagens) e da sua compatibilidade com a mistura em uma solução de uma solução paramagnética como o gadobutrol usado aqui. Para o diagnóstico de doenças, aplicações compatíveis incluem aqueles em que (i) as células de interesse inerentemente tem uma densidade alterada quando executam uma doença em comparação com controlos saudáveis, (ii) uma alteração da densidade pode ser induzida na célula através da adição de um reagente ou alguns tratamento alternativo para uma curta emcubation tempo, ou (iii) diferentes tipos de células estão a ser identificados numa única amostra e inerentemente (ou através de algum tipo de tratamento) têm densidades características únicas.

A doença das células falciformes é uma desordem genética que causa uma forma mutada da hemoglobina, da HbS, a ser produzido em células vermelhas do sangue de uma pessoa (RBCs), que pode resultar em efeitos vaso-oclusivas intermitentes e anemia hemolítica crónica ^9. Ela é diagnosticada usando hemoglobina focalização isoeléctrica, cromatografia líquida de alta eficiência eletroforese (HPLC) fracionamento, ou hemoglobina, que são altamente precisos, mas deve ser realizado em um laboratório de ensaio clínico porque são incompatíveis com as configurações de ponto-de-cuidado. Solubilidade e testes baseados em papel para a doença falciforme têm sido propostas, mas geralmente exigem interpretação usuário subjetiva e teste de confirmação. Aqui, utilizamos uma abordagem baseada em densidade para identificar hemácias falciformes, que alcançam uma densidade mais elevada do que RBCs de pessoas sem doença falciforme. O mecanismo envolve a polimerização da forma mutada da hemoglobina, HbS, o que provoca a desidratação RBC nas hemácias falciformes em condições desoxigenadas ^{10, 11, 12, 13.}

Esta abordagem baseada em densidade também pode ser aplicado para separar as células de diferentes tipos com base na densidade: células brancas do sangue (leucócitos) e hemácias ^7. Glóbulos brancos são geralmente responsáveis ​​pelo combate a infecções no corpo. citometria de WBC pode ser utilizado para quantificar o número destas células no sangue e funciona como uma ferramenta de diagnóstico útil. As contagens de WBC elevado do que o normal (geralmente considerado maior do que 11.000 células por uL) pode indicar uma infecção, perturbações do sistema imunitário, ou leucemia. As contagens de WBC abaixo do intervalo normal (cerca de 3.500 células por uL) pode ser causada por distúrbios auto-imunes ou Conditiões que danos medula óssea. Ao contrário de tecnologias alternativas, o processo aqui apresentado não depende de lise dos glóbulos vermelhos ou manchas, a fim de identificar os glóbulos brancos. Este teste baseado em células aproveita as densidades inerentes únicas dos dois tipos de células para realizar a separação, tal como a densidade de população de GB tem sido relatada como sendo menor do que a da população de glóbulos vermelhos, como calculado anteriormente, utilizando o gradiente de densidade de centrifugação ^{2, 3.}

Em comparação com os testes alterativo em locais remotos, este ensaio é rápido, simples com a preparação da amostra (Figura 3), a separação das células no dispositivo dentro de 10 – 15 min, e de imagem e análise automatizada que requer menos de 1 min. Desta forma, o dispositivo pode retornar resultados rapidamente para informar melhor as decisões médicas, permitir o tratamento a ser administrado imediatamente para aliviar a dor física e psicológica, e reduzir o risco de complicações associado a um atraso no atendimento médico. Esta técnica pode ser realizado no local, quer em situações clínicas, devido a uma preparação simples da amostra e análise de imagem automatizado e que retorna um resultado com a entrada ou a interpretação mínima do utilizador. Por causa da utilização de uma abordagem simples utilizando ímans permanentes para a análise da amostra e o uso de qualquer um aparelho ou componentes eléctricos simples para imagiologia e de processamento de imagem, o dispositivo, bem como o custo por teste são mínimos em comparação com alguns procedimentos de teste sofisticados.

Protocol

Declaração de ética: Todos os procedimentos envolvendo amostras de sangue humano foram realizadas de acordo com as normas institucionais. Todos os protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional. Um consentimento informado foi dado por todos os participantes. Preparação 1. Amostra de Doença Falciforme Diagnóstico 5, 8 Prepara-se uma solução 50 mM de gadobutrol em Solução Sali…

Representative Results

Para a análise de distribuição de densidade de células, que é a técnica utilizada para o diagnóstico da doença das células falciformes, o objectivo é o de identificar a largura da distribuição da população de células. As células do sangue de pacientes sem doença falciforme serão confinados dentro de uma largura previsível. Células de pacientes com a doença das células falciformes será distribuído ao longo de uma região mais larga, com uma inclinação para baixo …

Discussion

Passos críticos dentro do Protocolo
factores críticos neste processo incluem o alinhamento adequado dos magnetos. Se os ímãs tornar-se desalojado ou separados mais do que o normal no interior do dispositivo, isso pode afetar os resultados. Para controlar esta falha ou outros no processo, uma partícula controlado por densidade, tais como microesferas de poliestireno, pode ser utilizado periodicamente para controlar as variações ao longo do tempo. Além disso, o tempo de levitação é importante para permit…

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201