Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.
Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.
CD4 + CD25 + FOXP3 + regulerende T-cellen (Tregs) onderdrukken andere immuuncellen en zijn kritische mediatoren van perifere tolerantie voorkomen autoimmuniteit en overmatige ontsteking 1. Het belang van Tregs wordt geïllustreerd door de menselijke ziekte immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathie X-gebonden syndroom (IPEX), waarbij verlies van Tregs door mutaties in het `master' Treg transcriptiefactor forkhead box P3 (FOXP3) leidt tot ernstige systemische auto-immuunziekte, dodelijke op jonge leeftijd. Echter, Tregs fungeren als een tweesnijdend zwaard in het immuunsysteem als ze ook kunnen belemmeren anti-tumor immuniteit in bepaalde instellingen 2. Therapeutische manipulatie van Treg aantal en de functie is dan ook om tal van klinisch onderzoek onderworpen. Bij kanker kunnen depletie van Tregs gewenst zijn en enig succes van klinische benaderingen bevordert verder onderzoek 3. In auto-immuun- en ontstekingsziekten, in aanvulling op therapeutische werking van Tregs in several muis ziektemodellen, recent als eerste in-man proeven van adoptieve Treg overdracht te voorkomen graft versus -host ziekte (GvHD) 4-7 en de veiligheid in de behandeling van type 1 diabetes 8 beoordelen toonde veelbelovende resultaten.
Natuurlijk voorkomende Tregs (nTregs) omvatten-thymus afgeleide tTregs en perifeer veroorzaakte pTregs, met niet-redundante essentiële functies voor het behoud van de gezondheid van 9-11. Echter, nTreg aantallen zijn beperkt, het stimuleren van de complementaire aanpak van het induceren van Tregs (iTregs) in vitro van naïeve T-cel voorlopers 12. Still stabiliteit van iTregs, waarschijnlijk door een gebrek aan demethylering in de zogenoemde Treg-gedemethyleerde specifieke regio (TSDR) in FOXP3 gen locus 13, een punt van zorg en verschillende studies geven aan dat in vivo geïnduceerde Tregs stabieler 14.
Tot op heden, FOXP3 blijft de beste eiwit mArker voor Tregs, maar het is niet absoluut specifiek omdat conventionele menselijke CD4 + CD25 T-cellen die tijdelijk gemiddeld niveau van expressie FOXP3 bij activering 15,16. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het ophelderen van de regulering van FOXP3 meningsuiting, nog veel te ontdekken met betrekking tot de inductie, de stabiliteit en de functie van FOXP3 name in menselijke cellen. Ondanks verschillen nTregs in vitro geïnduceerde FOXP3 + CD4 + T-cellen kunnen worden gebruikt als een modelsysteem voor de moleculaire mechanismen van FOXP3 inductie bestuderen en als uitgangspunt voor protocollen in de toekomst die het mogelijk maken voor het genereren van iTregs die meer lijken op in zijn ontwikkeling vivo gegenereerd Tregs, die van toepassing zijn voor adoptieve overdracht strategieën in de toekomst zou kunnen zijn.
Noch `goud standard' protocol menselijke iTregs induceren en huidige protocollen werden ontwikkeld volgens nabootsen Treg-inducerende omstandigheden in vivo: interleukine 2 (IL-2) En transformerende groeifactor β (TGF-β) signalering cruciaal voor FOXP3 inductie in vivo 17, en all-trans retinoïnezuur (ATRA) – die in vivo wordt geproduceerd door de darm geassocieerde dendritische cellen – wordt vaak gebruikt om FOXP3 inductie verbeteren in vitro 18-21. We hebben extra personeel Treg-inducerende protocollen gebruikt butyraat 22, een darmflora afkomstige korte keten vetzuur dat recentelijk werd aangetoond dat murine Treg inductie 23,24 vergroten ontwikkeld. We hebben ook onlangs een nieuw protocol voor het genereren van iTregs met superieure onderdrukkende functie in vitro met behulp van een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine 22, waarbij de laatste een klinisch goedgekeurd zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR-remmer) waarvan bekend is dat te bevorderen FOXP3 onderhoud tijdens de menselijke Treg expansie 25,26.
Deze methode beschrijft de reproduceerbaarvitro genereren van humane CD4 + FOXP3 + iTregs met een aantal verschillende omstandigheden, en de latere fenotypering van flowcytometrie en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) protocol-specifieke expressiepatronen van FOXP3 en andere Treg handtekening moleculen openbaren zoals CD25, CTLA-4, EOS, en onderdrukking van IFN-γ en SATB1 expressie 22. De gegenereerde celpopulaties kan worden gebruikt voor functionele bepalingen inzake onderdrukkende activiteit of voor moleculaire studies, ofwel betreffende algemene FOXP3 regulators of effecten specifiek voor bepaalde verbindingen zoals butyraat of rapamycine bestuderen. Verder inzicht in de moleculaire mechanismen die Treg differentiatie is zeer relevant voor toekomstige therapeutische benaderingen in auto-immuniteit of kanker om specifiek te richten moleculen betrokken bij Treg generatie en functie.
De beschreven protocol kan de robuuste inductie van menselijke CD4 + FOXP3 + iTregs van naïeve humane CD4 + T-cellen. Het omvat een nieuw protocol dat we onlangs beschreven met een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine, voor inductie van iTregs met superieure in vitro onderdrukkende functie 22. In vergelijking met andere gepubliceerde protocollen ander voordeel is de inductie van verschillende iTreg populaties parallel door verschillende protocollen, die de directe vergelijking van de…
The authors have nothing to disclose.
Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.
All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |||
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |||
anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |||
anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |||
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |||
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |||
anti-human CD45RA , FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |||
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |||
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |||
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |||
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |||
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |||
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |||
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |||
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |||
DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |||
FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |||
Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |||
Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution, contains Paraformaldehyde Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
||
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |||
human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |||
![]()
|
![]()
|
130-094-131 | |||
Human serum albumin 50 g/l | Baxter | 1501057 | |||
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |||
MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug | eBioscience | 11-4714-81 | |||
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |||
Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |||
PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |||
Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |||
Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |||
Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |||
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |||
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |||
Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |||
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |||
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |