Этот протокол описывает воспроизводимую генерацию и фенотипирования человеческих индуцированных регуляторных Т – клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т – клеток в пробирке. Различные протоколы для индукции FOXP3 позволяют для изучения конкретных фенотипов iTreg, полученных с помощью соответствующих протоколов.
Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.
CD4 + CD25 + FOXP3 + регуляторные Т – клетки (Tregs) подавляют другие иммунные клетки и являются критическими медиаторами периферической толерантности, предотвращая аутоиммунные и чрезмерное воспаление 1. Важность Tregs можно проиллюстрировать на примере человеческой болезни immunodysregulation polyendocrinopathy энтеропатия Х-хромосомой синдромом (IPEX), в котором потеря Tregs из-за мутаций в `master' Treg фактора транскрипции Forkhead коробки P3 (FOXP3) приводит к тяжелым системным аутоиммунным заболеванием, летальной в раннем возрасте. Тем не менее, Tregs действовать как обоюдоострый меч в иммунной системе , поскольку они также могут препятствовать противоопухолевый иммунитет в определенных условиях 2. Терапевтическая манипуляция числа Treg и функции, поэтому предметом многочисленных клинических исследований. При раке, истощение Tregs может быть желательным и некоторый успех клинических подходов стимулирует дальнейшие исследования 3. При аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в дополнение к терапевтическим эффектам Tregs в Seveмодели заболевания RAL мыши, недавние первые испытания в-человека усыновителей передачи Treg для предотвращения трансплантат против -host (РТПХ) 4 – 7 и для оценки безопасности при лечении диабета типа 1 8 показали весьма обнадеживающие результаты.
Встречающиеся в природе Tregs (nTregs) содержат тимуса производные tTregs и периферического индуцированные pTregs, с нерезервированных важных функций в поддержании здоровья 9 – 11. Тем не менее, цифры nTreg ограничены, поощряя дополнительный подход индукции Tregs (iTregs) в пробирке из наивных предшественников Т – клеток 12. Тем не менее устойчивость iTregs, предположительно , из – за отсутствия деметилирования в так называемой Трег-специфической деметилируется области (TSDR) в гене FOXP3 локуса 13, остается проблемой , и некоторые исследования указывают на то, что в естественных условиях индуцированной Tregs более стабильны 14.
На сегодняшний день FOXP3 остается лучшим белком мarker для Tregs , но это не совсем специфический , потому что человеческие обычные CD4 + CD25- Т – клетки скоротечно выражают промежуточные уровни FOXP3 при активации 15,16. Несмотря на значительный прогресс был достигнут в выяснении регуляции экспрессии FOXP3, многое еще предстоит открыть в отношении индукции, стабильности и функции FOXP3 особенно в клетках человека. Несмотря на различия в nTregs, в пробирке индуцированной FOXP3 + CD4 + Т – клетки могут быть использованы в качестве модельной системы для изучения молекулярных механизмов индукции FOXP3 и в качестве отправной точки для разработки протоколов в будущем , которые позволяют поколения iTregs, которые более похожи на в Vivo сгенерированный Tregs, который может быть применим для усыновителей стратегий передачи в будущем.
Там нет `золотой standard' протокол , чтобы побудить человека iTregs, и в настоящее время протоколы были разработаны на основе имитируя Treg-индуцирующие условия в естественных условиях: интерлейкин – 2 (IL-2) И трансформирующий фактор роста β (TGF-β) сигнализации имеют решающее значение для FOXP3 индукции в естественных условиях 17, и все-транс – ретиноевой кислоты (ATRA) – который производится в естественных условиях с помощью связанной с кишечником дендритных клеток – часто используется для повышения индукции FOXP3 в пробирке 18 – 21. Мы разработали дополнительные человеческие Трег индуцирующего протоколы с использованием бутират 22, кишечную флору, происходящей с короткой цепью жирной кислоты , что недавно было показано , чтобы увеличить мышиный Treg индукции 23,24. Мы также недавно установили новый протокол для генерации iTregs с превосходной функцией подавляющих в пробирке, используя комбинацию TGF-бета, ATRA и рапамицина 22, причем последний клинически одобрен целевой рапамицина у млекопитающих (МРМ) ингибитор , который , как известно, содействовать техническое обслуживание FOXP3 в процессе расширения Treg человека 25,26.
Этот метод описывает воспроизводимавитро поколение человеческого CD4 + FOXP3 + iTregs с использованием набора различных условий, и их последующего фенотипирования с помощью проточной цитометрии и количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) , чтобы выявить закономерности , специфичные для протокола экспрессии FOXP3 и других Treg молекул подписи таких , как CD25, CTLA-4, EOS, а также репрессии IFN-gamma и экспрессии SATB1 22. Сформированные клеточные популяции могут быть использованы для функциональных анализов в отношении супрессивной активности или для молекулярных исследований, либо в отношении общих регуляторов FOXP3 или для изучения эффектов, характерных для определенных соединений, таких как бутират или рапамицином. Дальнейшее понимание молекулярных механизмов вождения Treg дифференциации является весьма актуальным для будущих терапевтических подходов в аутоиммунитета или рака специфически молекул-мишеней, участвующих в генерации и функции Treg.
Описанный протокол обеспечивает надежную индукцию человеческого CD4 + FOXP3 + iTregs от человека наивных CD4 + Т – клеток. Он включает в себя новый протокол , который мы описали в последнее время , с использованием комбинации TGF-бета, ATRA и рапамицином, для индукции iTregs с превосходной в проби…
The authors have nothing to disclose.
Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.
All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |||
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |||
anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |||
anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |||
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |||
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |||
anti-human CD45RA , FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |||
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |||
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |||
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |||
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |||
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |||
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |||
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |||
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |||
DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |||
FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |||
Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |||
Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution, contains Paraformaldehyde Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
||
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |||
human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |||
![]()
|
![]()
|
130-094-131 | |||
Human serum albumin 50 g/l | Baxter | 1501057 | |||
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |||
MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug | eBioscience | 11-4714-81 | |||
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |||
Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |||
PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |||
Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |||
Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |||
Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |||
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |||
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |||
Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |||
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |||
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |