칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

Summary

여기에서는 단백질-DNA 상호 작용의 염기쌍에 가까운 해상도를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP-exo)으로 선택적으로 농축된 DNA 단편의 엑소뉴클레아제 처리에 이어 고처리량 염기서열분석(high throughput sequencing)을 통해 얻을 수 있습니다.

Abstract

크로 마틴 면역 침강 (칩)은 후성 유전학 및 특정 단백질 DNA 상호 작용을 분리 유전자 조절의 분야에서 필수적인 도구입니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 서열)에 결합 된 칩은 일반적으로 염색질 상호 작용 단백질의 게놈 위치를 결정하기 위해 사용된다. 그러나, 칩 서열은 수백 염기쌍 비교적 낮은 매핑 해상도 및 높은 백그라운드 신호에 의해 방해된다. 칩 엑소 방법은 실질적으로 해상도 및 노이즈 모두 개선 한 칩 서열의 정제 된 버전이다. 칩 엑소 방법론의 키 차이는 효과적으로 왼쪽 풋 프린트 라이브러리 준비 워크 플로의 람다 엑소 뉴 클레아 제 소화의 설립 및 단백질 DNA의 가교 사이트의 오른쪽 5 'DNA 테두리입니다. 칩 엑소 라이브러리는 다음 높은 처리량 시퀀싱을 실시한다. 얻어진 데이터는 기능적 조직 O에 고유 초 고해상도 통찰력을 제공하기 위해 활용 될 수있다게놈 바. 여기, 우리는 우리가 최적화 및 포유류 시스템과 차세대 시퀀싱 합성에 의한 플랫폼 간소화 한 칩 - 엑소 방법을 설명합니다.

Introduction

크로 마틴 면역 침강 (칩)을 선택적으로 살아있는 세포에서 특정 단백질과 상호 작용하는 DNA 단편을 위해 농축에 의해 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 강력한 방법이다. 기술은 높은 처리량 시퀀싱 (칩-SEQ) ¹ 올리고 뉴클레오티드 마이크로 어레이 (칩 - 칩)에 하이브리드에 하나의 궤적 (표준 칩-qPCR에) 검출에서 향상으로 칩 농축 DNA 단편의 검출 방법은 진화했다. 칩-서열이 광범위한 응용 프로그램, 염색질 이질성과 비특이적 DNA 상호 작용을 볼 수 있지만 오탐 (false positive)과 부정확 한 매핑 최고의 데이터 품질을 방해했다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 박사 프랭크 퓨는 칩 - 엑소 방법 ^(2)를 개발했다. 칩 엑소의 두드러진 특징은 효율적으로 위치를 결합 전사 인자를 footprinting에, 엑소 뉴 클레아 '3', 5를 포함하고 있다는 것이다. 결과적으로, 칩 - 엑소 방법은 높은 해상도 detectio의 큰 동적 범위를 달성n 및 낮은 소음.

칩 - 엑소 좀 더 기술적으로 어려운 칩-서열보다 마스터하지만 연구는 다양한 생물학적 시스템 ^3-8를 사용하여 고유의 초 고해상도 통찰력을 확보하는 것을 목표로, 그것은 널리 채택되고있다. ....

Protocol

참고 : 두 번 증류수 H ₂ O 또는 분자 수준의 상응하는 모든 버퍼와 반응 믹스하는 것이 좋습니다.

날 0 : 재료 준비 및 세포 수확

1. 버퍼 준비

1. 3 (표 1 - - 3) 용해 버퍼 (1)을 준비하고 사용하기 직전에 각 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 완전한 단백질 분해 효소 억제제 재고 (CPI)를 추가합니다. 1 정 1 ml의를 분자 수준의 H ₂ O를 용해하여 CPI 재고를 준비
2. 칩 버퍼 (- 7 표 4)를 준비합니다. 차단 및 RIPA 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 소비자 물가 지수의 주식을 추가합니다. 트리스와 칩 용출 버퍼 CPI를 추가하지 마십시오.

어댑터 올리고 뉴클레오티드의 2 어닐링

주 : 특정 뉴클레오티드 서열은 부가 정보 섹션에서 찾을 수있다.

1. 어댑터 어닐링 믹스 (- 9 표 8)를 준비합니다. 혼합하는 소용돌이 짧게컨텐츠 수집 튜브에 ....

Results

다음 그림은 여기에 제시된 칩 - 엑소 프로토콜 대표 결과를 보여줍니다. 몇 효소 단계를 기존의 칩-SEQ 방법과는 달리, 칩 - 엑소는 열한 순차적으로 의존 효소 반응 (그림 1)가 필요합니다. 따라서, 치료는 각 반응 성분이 각각의 반응 마스터 믹스에 추가되도록 각 단계에서 수행되어야한다. 우리는 생성 된 표를 인쇄하는 자동 반응 마스터 믹스 계산을 수행하는 반응 테이블에 기초하여 공식화 된 스프레드 시트를 생성하고,이를 마스터 믹스를 첨가 한 후 각 항목을 확인 바랍니다.

우리는 고품질 시퀀싱 결과 (도 2)를 확인하기 위해 프로토콜을 통하여 품질 관리 방법들을 이용한다. 각 칩의 반응은 세 가지 기본 구성 요소가 포함되어 있습니다 : 1) intere의 세포에서 염색질 추출물을 초음파세인트 관.......

Discussion

우리는 염색질 근처 염기쌍 해상도 편견, 게놈 차원의 방식으로 단백질 상호 작용에 대한 정확한 결합 위치를 결정하기 위해 기능 유전체학 프로토콜을 제시한다. 면역 침전이 자성 수지에 남아있는 동안 근처 염기쌍 매핑 해상도를 얻기 위해 가장 중요한 단계는 칩 - 풍부 DNA의 엑소 뉴 클레아 제 처리이다. 표면 상, 단백질 복합체는 잠재적으로 주어진 서브 유닛 (예를 들어, 크로 마틴 리모델링 복합체 또는 뉴 클레오 코어 입자)의 생체 배출량 측정을 차단할 수 있습니다. 포름 알데히드 가교제 비효율적이기 때문에,로가 이전에보고 된 ^10, 그것은 더욱 복잡한 다중 소단위는 DNA에 가교 것 같지는 같은 궤적에서 동일 셀 내의 서로된다. 따라서, 이러한 뉴 클레오의 개별 히스톤 서브 유닛과 같은 단백질 복합체의 개별 서브 유닛의 생체 배출량 측정에서, 칩 - 엑소 가능합니다.

t는 "> 칩 - 엑소의 가장 주목할만한 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% 포름알데히드, 메탄올 무함유, 10 x 10ml 앰플	ThermoFisher Scientific	28908	Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI)	Roche Life Science	11873580001	Sections 4, 8
Bioruptor sonicator	Diagenode	UCD200	Section 5
15 ml 폴리스티렌 튜브	BD Falcon	352095	Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads	GE Healthcare	28-9670-66	Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack	Invitrogen	12321D	Section 6-17, 22
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	05-450-127	Section 7, 22
T4 DNA Polymerase	New England BioLabs	M0203	Section 9
DNA Polymerase I, Klenow	New England BioLabs	M0210	섹션 9
10x NEBuffer 2 (10x 반응 버퍼 2)	New England BioLabs	B7002	섹션 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C	Eppendorf	5382	섹션 9-16
ATP	Roche Life Science	010419979001	섹션 9, 11, 13
dNTP	New England BioLabs	N0447	섹션 9, 12, 19, 23
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제	New England BioLabs	M0201	섹션 9, 13
dATP	New England BioLabs	N0440	섹션 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus	New England BioLabs	M0212	섹션 10, 20
T4 DNA 리가제	New England BioLabs	M0202	섹션 11, 21
Φ-29 DNA 중합효소	New England BioLabs	M0269	섹션 12,
19 10x Φ-29 버퍼	New England BioLabs	B0269	섹션 12, 19
Lambda 엑소뉴클레아제	New England BioLabs	M0262	섹션
14 10x Lambda 버퍼	New England BioLabs	B0262	섹션 14
RecJf Exonuclease	New England BioLabs	M0264	Section 15
Proteinase K	Roche Life Science	03115828001	Section 16
Glycogen	Roche Life Science	010901393001	Section 18
10x T4 Ligase Buffer	New England BioLabs	B0202	Section 21
AMPure XP (clean up) 비즈	벡크만 콜터	A63881	섹션 22
Q5 핫 스타트 DNA 중합효소	New England BioLabs	M0493	Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)	New England BioLabs	B9027	Section 23
QIAquick Gel 추출 키트	Qiagen	28704	Section 25
Qubit Fluorometer	Invitrogen	Q33216	Section 26
Optical Clear Qubit tubes	Invitrogen	Q32856	Section 26
Qubit dsDNA 고감도 어세이 키트	Invitrogen	Q32851	Section 26