वर्तमान प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे पश्चिमी सोख्ता और लाइसोसोमल एंजाइमों के निषेध के साथ संयुक्त immunocytochemistry सिलिअरी neurotrophic कारक रिसेप्टर-α (CNTFRα), जो साइटोकाइन तरह फैक्टर -1 (जमानती-1 के बीच बातचीत से अवगत करा दिया है डाउनरेगुलेशन प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ) और endocytic रिसेप्टर sorLA।
heterodimeric साइटोकाइन Cardiotrophin-तरह साइटोकाइन: साइटोकाइन तरह फैक्टर -1 (सीएलसी: जमानती-1) (लक्ष्य glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई) CNTFRα -anchored एक trimeric जटिल है कि बाद में ग्लाइकोप्रोटीन रंगरूटों 130 / लेकिमिया निरोधात्मक कारक रिसेप्टर-β के लिए फार्म gp130 / LIFRβ) संकेतन के लिए। दोनों सीएलसी और CNTFRα संकेत लेकिन अब तक जमानती -1 केवल सीएलसी स्राव के एक ख्यात सुविधा के रूप में जाना जाता रहा है के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, यह हाल ही में दिखाया गया है कि जमानती -1 तीन बाध्यकारी साइटों में शामिल किया गया है: सीएलसी के लिए एक; CNTFRα के लिए एक (कि trimeric परिसर के विधानसभा बढ़ावा कर सकते हैं); और endocytic रिसेप्टर sorLA के लिए एक। जमानती -1, साथ ही trimeric (सीएलसी: जमानती-1: CNTFRα) उत्तरार्द्ध साइट उच्च आत्मीयता जमानती -1, सीएलसी के बंधन प्रदान करता है sorLA करने के लिए जटिल है, और में घुलनशील ligands जमानती -1 और सीएलसी sorLA व्यक्त कोशिकाओं : जमानती -1 तेजी से ऊपर ले लिया है और भली भाँति रहे हैं। कोशिकाओं सह व्यक्त CNTFRα और sorLA में, CNTFRα पहले सीएलसी बांधता: जमानती-1 के लिए फार्मएक झिल्ली जुड़े trimeric जटिल है, लेकिन यह भी sorLA को जमानती -1 में मुक्त sorLA बाध्यकारी साइट के माध्यम से जोड़ता है। नतीजतन, CNTFRα, जो अपने दम पर endocytosis के लिए कोई क्षमता है, साथ tugged और सीएलसी के sorLA की मध्यस्थता endocytosis से भली भाँति है: जमानती -1।
वर्तमान प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक मैं प्रदर्शित करने के लिए) sorLA की मध्यस्थता और सीएलसी इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं का वर्णन करता है: सतह की झिल्ली CNTFRα अभिव्यक्ति की जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन; ii) sorLA की मध्यस्थता endocytosis और लाइसोसोमल CNTFRα का निशाना बना; और iii) सीएलसी के लिए उतारा सेलुलर प्रतिक्रिया: जमानती-1-उत्तेजना CNTFRα की sorLA की मध्यस्थता डाउनरेगुलेशन पर।
जमानती -1 1-3: सीएलसी और जमानती -1 heterodimeric साइटोकाइन सीएलसी की दो यूनिटों का गठन। सेलुलर संकेत शामिल करने के लिए, सीएलसी: जमानती -1 पहला लक्ष्य CNTFRα, इसका प्राथमिक और जीपीआई लंगर रिसेप्टर, एक झिल्ली ही सीमित trimeric जटिल बनाने के लिए। सीएलसी: जमानती-1: CNTFRα जटिल बाद में रंगरूटों gp130 / LIFRβ जो transmembrane जानूस Kinase / सिग्नल ट्रान्सड्यूसरों और ट्रांसक्रिप्शन 3 (जे ए / Stat3) मार्ग 4 की Activators के माध्यम से संकेत मध्यस्थता करता है। चूहे तीन यूनिटों में से किसी में कमी एक प्रदर्शन और एक ही phenotype और चेहरे न्यूरॉन्स और अपर्याप्त दूध पिलाती 5-8 की संख्या कम होने के कारण 24 घंटे के भीतर जन्म के बाद मर जाते हैं। मानव में निष्कर्ष इसी तरह तीन यूनिटों के कार्यात्मक जुटना को रेखांकित। इस प्रकार, मानव म्यूटेशन (homozygote या यौगिक) सीएलसी के कारण रोग: जमानती -1 या CNTFRα, तथाकथित ठंड प्रेरित पसीना / Crisponi सिंड्रोम में सभी परिणाम, एक की हालत ऐसी impai जैसे लक्षणों की विशेषतालाल दूध पिलाती और निगलने, विभिन्न कुरूपता सुविधाओं, तापमान spikes, और उलटी और निम्न तापमान 9-11 पर पसीना आ रहा है छिड़कना।
इन विट्रो में, सीएलसी और CNTFRα के संयोजन दोनों आवश्यक और और gp130 / LIFRβ के साथ बातचीत कोशिकाओं 12 में संकेत के शामिल होने के लिए पर्याप्त है। दूसरी ओर जमानती -1 की भूमिका कम स्पष्ट है। यह सीधे संकेतन में शामिल नहीं है, और लंबे समय तक एक परिशिष्ट है कि मुख्य रूप से सीएलसी 1 के सेलुलर स्राव की सुविधा के लिए कार्य करता है के रूप में माना गया है। हालांकि, हाल के निष्कर्ष है कि जमानती -1 इसमें संकेत और सीएलसी और CNTFRα का कारोबार फंसाने अतिरिक्त और अधिक महत्वपूर्ण कार्य किया है दिखाने के लिए। इस प्रकार, यह प्रतीत होता है कि जमानती -1 तीन स्वतंत्र बाध्यकारी साइटों में शामिल हैं: एक के लिए अपने प्रसिद्ध सीएलसी के लिए बाध्य; कि प्रत्यक्ष CNTFRα के लिए बाध्यकारी मध्यस्थता एक; और endocytic रिसेप्टर sorLA के साथ बातचीत के लिए एक तिहाई (उच्च आत्मीयता) साइट। दोनों के रूप में सीएलसी और जमानती -1 लग & #160; सीएलसी की तुलना में काफी कम आत्मीयता के साथ CNTFRα निशाना बनाने के लिए: जमानती -1 जटिल है, यह कल्पना है कि जमानती -1 (अपने CNTFRα बाध्यकारी साइट के माध्यम से) सीएलसी और CNTFRα के एकीकरण को बढ़ावा देता है और इस तरह 13 सिगनल की सुविधा।
sorLA साथ जमानती -1 की बातचीत, वर्तमान प्रस्तुति का मुख्य मुद्दा है, एक पूरी तरह से अलग भूमिका निभाता है। SorLA पांच प्रकार 1 रिसेप्टर्स कि Vps10p-डोमेन रिसेप्टर परिवार 14 गठन में से एक है। यह ऊतकों की एक किस्म में लेकिन मस्तिष्क और neuronal ऊतकों 15 में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है। परिवार के अन्य सदस्यों के लिए इसी प्रकार sorLA एक एन टर्मिनल ligand Vps10p-डोमेन बाध्यकारी किया जाता है, लेकिन इसके अलावा, यह भी कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर परिवार के सदस्यों के 15 में पाया ligand बाध्यकारी तत्वों सहित अन्य डोमेन प्रकार शामिल हैं। इसके cytoplasmic पूंछ कई एडाप्टर प्रोटीन, जैसे, अनुकूलक प्रोटीन -1 और -2, और sorLA के साथ सूचना का आदान प्रदान कुशल endocytos बता देते हैंहै साथ ही साथ intracellular छँटाई और बाध्य प्रोटीन 16-18 के परिवहन। Vps10p-डोमेन के एक बड़े दस पंखों β-प्रोपेलर 19,20, जो जमानती -1 (लेकिन विशेष रूप से, सीएलसी नहीं) 13 सहित असंबंधित ligands की एक श्रृंखला बांधता शामिल हैं। जमानती -1 में बाध्यकारी साइट पहुँचा जा सकता है के बाद भी जिसका अर्थ है कि sorLA न केवल बांधता सीएलसी और CNTFRα साथ जटिल गठन मुक्त जमानती -1, लेकिन यह भी सीएलसी: जमानती -1 और trimeric जटिल सीएलसी: जमानती-1: CNTFRα 13। SorLA जमानती -1 और सीएलसी के तेजी से endocytosis बता देते हैं: जमानती -1, लेकिन इन घुलनशील प्रोटीन CNTFRα एक जीपीआई-लंगर से सतह की झिल्ली को तय हो गई है, जबकि रहे हैं। सवाल इसलिए अगर सीएलसी के बंधन जाता है: जमानती-1: CNTFRα sorLA पूरे परिसर internalize करने के लिए अनुमति देता है और इस तरह CNTFRα की सतह की झिल्ली अभिव्यक्ति (और सीएलसी के लिए बाद सेलुलर संवेदनशीलता: जमानती -1 संकेत प्रेरण) को बदलने के लिए, और / या CNTFRα का कारोबार।
प्रयोगों वर्तमान में वर्णितरिपोर्ट के बाद सवालों को स्पष्ट करने के लिए बनाया गया:
sorLA सीएलसी मध्यस्थता करता है: सतह की झिल्ली CNTFRα के जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन? यह स्पष्ट करने के लिए, यह शुरू में 21 में वर्णित के रूप CNTFRα का कारोबार निर्धारित करने के लिए चयापचय लेबलिंग और नाड़ी-चेस प्रयोगों के माध्यम से (अनुपस्थिति और sorLA की उपस्थिति में) की कोशिश की थी। हालांकि, CNTFRα [एस 35] सिस्टीन का एक मिश्रण का उपयोग कर और [एस 35] methionine रेडियोधर्मिता के गरीब समावेश दिखाया लेबल करने के लिए प्रयास करता है। इस नए-संश्लेषण का एक बहुत कम डिग्री है, जो सभी संभावना में रिसेप्टर्स के अचानक और महत्वपूर्ण नुकसान की भरपाई करने में असमर्थ होगा सुझाव दिया। यदि CNTFRα जब सीएलसी के माध्यम से जुड़े downregulated था निर्धारित करने के लिए: जमानती -1 sorLA करने के लिए, इसलिए यह (पश्चिमी सोख्ता का उपयोग) पहले और सीएलसी से संपर्क के बाद बस को मापने के लिए CNTFRα की कुल सेलुलर पूल का फैसला किया गया था: जमानती-1 – और परिणामों की तुलना करने कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट या साथ ट्रांसफ़ेक्ट नहींsorLA।
sorLA लाइसोसोम को CNTFRα लक्ष्य है? इस सवाल का, CNTFRα के स्थानीयकरण का जवाब है – अपने सीएलसी के माध्यम से भली भाँति: जमानती-1-मध्यस्थता sorLA के लिए बाध्य – immunocytochemistry का उपयोग कर जांच की गई थी, और और CNTFRα की ओर निर्देशित एंटीबॉडी देर इंडो सोम / lysosome मार्कर लाइसोसोमल जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 के साथ लेबलिंग (दीपक -1)। प्रयोग लाइसोसोमल एंजाइमों के अवरोधकों के साथ इलाज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इलाज कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया था। विचार कोर्स की थी कि अगर CNTFRα लाइसोसोम में अपमानित किया गया था, एंजाइम inhibitors के साथ इलाज किया कोशिकाओं, CNTFRα धुंधला दीपक -1 सकारात्मक पुटिकाओं में जमते पेश अनुपचारित कोशिकाओं CNTFRα के लिए कम या कोई धुंधला दिखा सकते हैं, जबकि होगा।
जमानती -1 उत्तेजना: CNTFRα डाउनरेगुलेशन सीएलसी के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को कम करता है? trimeric gp130 / LIFRβ heterodimer जे ए / Stat3 का उपयोग कर के माध्यम से सीएलसी, जमानती-1, और CNTFRα संकेतों से मिलकर जटिलमार्ग। तदनुसार, कोशिकाओं की क्षमता सीएलसी के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए: CNTFRα के डाउनरेगुलेशन पर जमानती -1 सिगनल पश्चिमी धब्बा का पता लगाने और phospho-Stat3 (pSTAT3) / sorLA transfectants में कुल Stat3 स्तर के quantitation द्वारा पता लगाया गया था।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से इस्तेमाल किया जा सकता sorLA की मध्यस्थता सीएलसी प्रदर्शित करने के लिए: जमानती-1-निर्भर डाउनरेगुलेशन और लाइसोसोमल CNTFRα का निशाना बना है, साथ ही सीएलसी करने के साथ कमजोर प्रतिक्रिया: जमानती -1 उत्तेजना।
HEK293 सेल लाइन इस प्रोटोकॉल के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, के रूप में वे CNTFRα और sorLA का केवल एक छोटी सी अंतर्जात अभिव्यक्ति है, transfect करने के लिए आसान, एक्सप्रेस gp130 / LIFRβ हैं, और एक बड़े सेल शरीर है, जो immunocytochemistry के लिए अनुकूल है। हालांकि, सिद्धांत रूप में इसी तरह की संपत्ति के साथ किसी भी कोशिका पंक्ति के रूप में अच्छी तरह से काम करना चाहिए।
प्रोटोकॉल दो महत्वपूर्ण कदम है। पहली चिंताओं 2.3, जिसमें लियू / पेप मध्यम 24 घंटे के लिए जगह होना चाहिए लगभग हर 6 घंटे के कदम। ऐसा करने में विफलता सक्रिय लाइसोसोमल एंजाइमों और कम या लाइसोसोम में प्रोटीन की नहीं detectable संचय में परिणाम हो सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम (3.4) सीएलसी के साथ पूर्व ऊष्मायन पर धोने चिंताएं: जमानती -1। यह IM हैअहम किसी भी अपार ligand दूर करने के लिए, और कोशिकाओं समय unsupplemented DMEM (खाली मध्यम) में (जारी उत्तेजना से बचने) ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए। जमानती-1 (3.5 चरण): यह सीएलसी के साथ बाद में फिर से उत्तेजना के दौरान pSTAT3 के एक कम पृष्ठभूमि के स्तर को सुनिश्चित करेगा।
विशेष रूप से, चित्रा 6 दर्शाता है कि सेलुलर प्रतिक्रिया (pSTAT3) CNTFRα की sorLA की मध्यस्थता डाउनरेगुलेशन के साथ समानांतर में कम हो जाती है। लेकिन उसे यह भी जोर दिया जाना चाहिए, हालांकि एक कम प्रतिक्रिया के साथ (और पर उम्मीद की जा करने के लिए) CNTFRα पूल की कमी अनुसार है, यह साबित नहीं है कि कम CNTFRα अभिव्यक्ति अकेले कम हो सेलुलर प्रतिक्रिया के लिए खातों। इस प्रकार, परिवर्तन – पूर्व उत्तेजना या अभिकर्मक से उत्पन्न – नदी के ऊपर pSTAT3 को संकेतन मार्ग के कार्यात्मक तत्वों में से किसी में बदल जवाबी कार्रवाई के लिए योगदान हो सकता है।
प्रोटोकॉल की मूल अवधारणा इस खासकर तक सीमित नहीं हैLAR रिसेप्टर प्रणाली। (। यानी एक और सेल लाइन, अन्य एंटीबॉडी, अन्य ligands, आदि) – sorLA's भागीदारी की परवाह किए बिना प्रोटोकॉल को संशोधित करके इसे अन्य रिसेप्टर्स की ligand प्रेरित डाउनरेगुलेशन के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रिसेप्टर downregulation पश्चिमी सोख्ता द्वारा की विश्लेषण मुख्य रूप से रिसेप्टर्स, जैसे, जीपीआई लंगर रिसेप्टर्स है, जो एक धीमी गति से कारोबार और unstimulated कोशिकाओं में नया संश्लेषण की एक डिग्री कम प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है। इस प्रकार, नए-संश्लेषण के एक उच्च स्तर दिखा रिसेप्टर्स में, ligand प्रेरित डाउनरेगुलेशन के लिए नए रिसेप्टर्स के संश्लेषण से मुआवजा दिया जा सकता है। इन परिस्थितियों में, रिसेप्टर पूल के डाउनरेगुलेशन बजाय चयापचय लेबलिंग और नाड़ी-चेस प्रयोगों के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है 21 में वर्णित है। वैकल्पिक रूप से, iodinated एंटीबॉडी (अधिमानतः एफसी-टुकड़े) कि रिसेप्टर के साथ हस्तक्षेप नहीं करते बाइंडिंग "टैग" RECEPT की ectodomain करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताया, और उम्मीद डाउनरेगुलेशन तो सेल गोली और मध्यम के रेडियोधर्मी गिनती के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
रसद कारणों से हम एक CNTFRα के साथ हमारी कोशिकाओं को एक Myc टैग ले जाने का निर्माण ट्रांसफ़ेक्ट, और वर्तमान प्रोटोकॉल में एक चूहे विरोधी Myc एंटीबॉडी रिसेप्टर के पश्चिमी धब्बा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके विपरीत, एक बकरी विरोधी CNTFRα एंटीबॉडी के रूप में दीपक -1 एक माउस एंटीबॉडी द्वारा खोजा गया था immunocytochemistry और डबल लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था – और स्पष्ट रूप से दो प्राथमिक माउस एंटीबॉडी के उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ unspecific (ओवरलैपिंग) धुंधला में नतीजा होगा। ध्यान दें कि जब से बकरी विरोधी CNTFRα भी पश्चिमी सोख्ता (नहीं दिखाया गया) में काम करता है, प्रोटोकॉल आसानी से संशोधित और untagged CNTFRα साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है।
अंत में, यह हाल ही में दिखाया गया है कि यह भी endocytic रिसेप्टर sortilin बांधता सीएलसी है: उच्च आत्मीयता 22 के साथ जमानती -1। इस प्रकार, यह कल्पना है कि sortilin है, जैसेsorLA, सीएलसी के लिए interconnects: जमानती -1 के माध्यम से CNTFRα और endocytosis और लाइसोसोमल CNTFRα के लक्षित कर के रूप में अच्छी तरह से मध्यस्थता करने में सक्षम है। sorLA के बजाय sortilin का उपयोग करना, वर्तमान प्रोटोकॉल इस सवाल का स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |