Live Imaging att studera mikrotubuli Dynamisk Instabilitet i taxan resistent bröstcancer
Summary
In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Abstract
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
Introduction
Den främsta orsaken till dödligheten i bröstcancer är genom metastaser 1, 2. Taxaner, såsom docetaxel och paklitaxel, används idag som första linjens behandling vid behandling av metastaserande bröstcancer 2, 3, 4, 5, 6. De är en del av en grupp av mikrotubuli-målsökande medel (MTA) som stör mikrotubuli dynamik. Men en av de största utmaningarna med att använda taxaner i botande behandling att utveckla taxan resistens i cancerceller, vilket leder till återfall i sjukdomen 7. Motstånd läkemedel står för mer än 90% av alla dödsfall bland patienter med metastaserande bröstcancer 7.
Mikrotubuli är bildade genom polymerisation av a- och P-tubulin-heterodimererclass = "xref"> 8, 9. Den exakta regleringen av mikrotubuli dynamik är viktig för många cellulära funktioner, inklusive cell polarisering, cellcykelprogression, intracellulär transport, och cellsignalering. Dysreglering av mikrotubuli och deras dynamik kommer att störa cellernas funktion och leda till celldöd 10, 11. Beroende på hur de orsakar denna dysreglering kan MTA droger klassificeras som antingen mikrotubuli stabiliseringsmedel (dvs taxaner) eller mikrotubuli-destabalizing medel (dvs, vinkaalkaloider eller colchicin plats bindemedel) 20. Trots deras motsatt effekt på mikrotubuli massa, vid en tillräcklig dos, kan båda klasserna döda cancerceller genom deras effekter på mikrotubuli dynamik 21.
Taxaner fungerar främst genom att stabilisera mikrotubuli spindeln 12, vilket leder tillkromosomala förskjutning. Den efterföljande ständig aktivering av spindelenhet checkpoint (SAC) hejdar cellen i mitos. Långvarig mitotiska arrestering orsakar då apoptos 13, 14. Taxan interagerar med mikrotubuli genom taxan bindningsställe på β-tubulin 8, 15, som endast finns i monterat tubulin 16.
Flera mekanismer för taxan motstånd har föreslagits 9, 17. Dessa mekanismer innefattar både allmän multiresistens på grund av överuttryck av läkemedelsutflödes proteiner och taxan specifika motståndet 5, 9, 18, 19. Till exempel, kan taxanresistenta cancerceller har förändrat uttryck och funktion av vissa β-tubUlin isotyper 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Genom att använda en in vivo metod för att mäta mikrotubuli dynamisk instabilitet, visar vi att, jämfört med icke-resistenta, föräldra MCF-7 CC celler 17, de mikrotubuli dynamik docetaxel-resistent MCF-7 TXT celler är okänsliga för docetaxel behandling.
För att bättre förstå funktionen hos MTA och den exakta mekanismen för taxan-resistens i cancerceller, är det viktigt att mäta mikrotubuli dynamik. Här rapporterar vi en in vivo-metod för att göra detta. Genom att använda levande avbildning i kombination med uttrycket av GFP-märkta tubulin i celler, kan vi mäta mikrotubuli dynamik MCF-7 TXT och MCF-7 CC-celler med och without docetaxel-behandling. Resultaten kan hjälpa oss att utforma mer effektiva läkemedel som kan övervinna taxan motstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns två viktiga metoder för att mäta mikrotubuli dynamisk instabilitet: in vitro och in vivo. I in vitro-metod, renas tubulin används för att mäta mikrotubuli dynamisk instabilitet med dator förbättrad time-lapse differential interferens kontrast mikroskopi. I in vivo-metoden, mikroinjiceras fluorescerande tubulin, eller uttryckt GFP-tubulin, har införlivats i mikrotubuli. Dynamiken (tillväxt och förkortning) av de mikrotubuli registreras sedan av tidsförlopp med anv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
