その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量
Summary
我々 は元素存在原体外数量化と同様に、人間の細胞を検出するための手順について説明します。メソッドは、任意のセル型に適してし、単一細胞の in vitro金属酸化物ナノ粒子曝露における定量的化学分析に特に役立ちます。
Abstract
化学元素イメージングに基づく微量分析の手法では、ローカリゼーションと細胞レベルで化学組成の定量を有効にします。彼らは生きているシステムの特性評価のための新しい可能性を提供、検出、ローカライズおよび金属酸化物ナノ粒子の生物的標本と環境の両方の存在を定量化に特に適して。確かに、これらの技術すべては (1 から 10 µg.g-1乾燥質量の最大) 感度 (i)、(ii) マイクロ メートルの範囲の空間分解能は、および (iii) 複数要素の抽出で関連する要件を満たします。これらの特徴を考えると、マイクロビーム化学元素イメージング力強く補完できるルーチンのイメージング技術など光と蛍光顕微鏡。このプロトコルでは、二酸化チタンのナノ粒子にさらされる培養細胞 (U2OS) の核マイクロ プローブ分析を実行する方法について説明します。細胞に成長する必要があり、光学顕微鏡で使用される特別に設計されたサンプル ホルダーに直接および核マイクロ プローブ分析段階で公開されます。思い切って凍結サンプルの低温固定細胞組織と元素分布の両方を保持します。同時核マイクロ プローブ分析 (走査型イオン顕微鏡、ラザフォード後方散乱分光法と粒子励起 x 線放射) サンプルに対して細胞密度のローカルの配布に関する情報を提供しますナノ粒子の細胞の内容と同様、化学要素。生物学、特に乗り越えるとをナノ粒子と生体試料間の相互作用の私達の理解を深める必要がありますナノメディシンの新興のコンテキスト内でこのような分析ツールの成長の必要性があります。特に、核マイクロ プローブ分析ナノ粒子ラベルを必要としない、ナノ粒子組成、表面の状態とは関係なく、細胞集団の個々 のセル レベルまで定量。
Introduction
生体のホメオスタシス、取り込みコントロール、同化、および別の微量元素 (外因性の無機化合物、金属イオン) の細胞内局在性によって決まります。これらのコンポーネントは、トレースの形では多くの場合がそれにもかかわらずシステム生理学に大きな影響を持つ可能性があります。したがって、正常と病理/強調した状況での細胞生化学的研究は、細胞の代謝機構の全体的な理解を目指してキー手順です。そのため、細胞内の化学的組成、構造とその関連代謝機能の調査を有効にするイメージング ・分析技術の開発が必要になります。非常にいくつかの方法がある特定のサンプルの全体的な化学的性質に関する情報の場で定量的な作品を提供することができます。別にバルク試料の分析の方法、その場で解析検討生体試料の整合性の質量や構造については、その成分の化学物質 (微量元素とイオン) は保持を失うことがなく、蛋白質。さらに、ナノサイエンスが発展するのにつれ、改良されたイメージングと細胞のスケールの環境モニタリングのための分析方法必要があります観察し、ナノ オブジェクトの動作との相互作用を定量化します。1
ナノ粒子 (NPs) は、範囲 1 から 100 nm の少なくとも 1 つの顔ディメンションを示すオブジェクトとして定義されています。2特定の物理化学的性質のため業界では広く NPs が使用します。NPs は、ナノメディシン、バイオ アプリケーションでを使用しています。3,4 NPs の多数の物理化学的特性、にもかかわらずに、彼らは人間の健康や環境に及ぼす悪影響のいくつかのリスクを生成可能性があります。これらのリスクを様々 な濃度で長期反復的な露出によって誘起すること、これがまだ確立されていない明確に。5,6,7,8特に、細胞と関連付けられている細胞の応答内の NPs の運命は、日付、完全には説明されています。これは検出を許可するメソッドの希少性と単一のセルに内面化された NPs の定量化のための一部です。9
ナノ粒子の細胞投与量が質量分析法 (MS) 系を推定する古典的な分析道具誘導結合プラズマ MS (ICP-MS)10,11と液体クロマトグラフィー MS (LC-MS)、しかし、彼らのみを提供マクロ スケールでの有用な情報。それらのどれもは、細胞内の NPs コンテンツも分別方法使用せず NPs 分布の正確な評価を提供できます。用量反応の体系的な評価は、こうして核マイクロ プローブ分析12,13, 放射光蛍光 x 線顕微鏡14 など原子の分光に基づく方法ではなく、これらのメソッドでは不可能です。と二次イオン質量分析 (SIMS)。15,16彼らは蛍光顕微鏡を用いて観察を補完するために、NPs 蛍光分子と分類することはできません、したがって、自然な状態で研究されている場合は特に、これらのメソッド、特に興味深いものです。ある程度としても、fluorophores が付いている NPs に接木される (i) 定量化は難しい NP あたりタグのレベルは知られている、(ii) NP 表面の化学修飾はその細胞の分布を変更可能性がありますので。
この記事では、形態と元素組成のメジャー、マイナー、生体試料のイメージングを目指して核プローブ技術の組み合わせに基づく方法に焦点を当てるし、濃度をトレースします。
核マイクロ プローブ分析特に生体内微量元素の測定に適していることを証明します。梁の横方向分解能 (1 に 0.3 μ m) と元素の検出感度 (10 µg.g 1 から-1乾燥質量) 細胞レベルでの研究に適しています。核プローブ技術は、放出後、サンプルで現在の原子と相互作用 (MeV エネルギー通常実行して) イオンビーム粒子検出 (光子、電子、イオン) に基づいています。細胞に生じる相互作用は、主に: 1) その基本的な状態に戻ってから原子光子の放出が続く原子の励起・ イオン化・ 2) 彼らのエネルギーおよび方向の変更につながる受信粒子の拡散。相互作用に関与する原子の放出粒子エネルギー簡便同定の測定。要素のマッピングを実行するには、イオン マイクロビーム繰り返しスキャンのサンプル表面上頻度が約 100 μ m2を含むいくつかの細胞で 100 部以上。生成された粒子が検出され、各ビームの位置に彼らのエネルギーが記録されます。粒子ビーム位置に従って並べ替え、データ処理の目的は、そのような粒子の排出を担当の構造を識別する方法します。ここで、正確に蛍光顕微鏡と検出し、生活と NP の相互作用の結果を調査するために細胞と細胞内のスケールで外因性の NPs を定量化する核マイクロ プローブ分析に基づくを説明します。システム。我々 は、細胞レベルで酸化チタン (TiO2 NPs) ナノ粒子集合体の場で数量の面でこのメソッドによって提供される機会に特に集中しなければなりません。
Protocol
Representative Results
Discussion
特に細胞内のレベルで、他のイメージング技術で何ができるを超えて有用な情報を提供する手法を提案します。そのイメージングの能力に加えて、核マイクロ プローブ分析法は、生体試料の組成に入る化学要素の定量化の可能性を提供しています。本研究ではひと細胞集団と TiO2 NPs にさらされる単一のセルに基づいて選択した領域の解析に焦点を当てて.他の技術との組み合わせは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
演出ビデオの編集、セルジュ ・ Borderes に感謝します。フランス国立研究機関は、研究プログラム チタン (ANR CES 2010 年、n ° CESA 009 01) をサポートしています。CNRS との統合活動として欧州共同体は、「サポートの公共および産業研究を使用してイオン ビーム技術 (精神)」EC 契約 n ° 227012 下を提供。この作品は、EC 契約第 317169 の下でマリー キュリー アクション -、「統合活動支援大学院研究とインターンシップで業界とトレーニングの卓越性」(スプライト、D1.3) として初期研修ネットワーク (ITN) によってサポートされています。C’NANO グランド シュッド ウエストと地域アキテーヌ研究プログラム TOX ナノ (n ° 20111201003) と研究プログラム POPRA (n ° 14006636 034) をサポートします。
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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