Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar
Summary
Biz kimyasal elementler mevcut içinde in situ insan hücreleri hem de onların vitro miktar tespiti için açıklayınız. Yöntem herhangi bir hücre tipi için uygundur ve Tek Kişilik hücrelerde vitro metal oksit nano tanecikleri pozlama takip kantitatif kimyasal analizler için özellikle kullanışlıdır.
Abstract
Mikro-analitik teknikler üzerinde kimyasal element görüntüleme dayalı Yerelleştirme ve hücresel düzeyde kimyasal kompozisyon miktar etkinleştirin. Yaşayan sistemler karakterizasyonu için yeni olanaklar sunmak ve algılama, Yerelleştirme ve metal oksit nano tanecikleri hem biyolojik örnekler ve çevre varlığı miktarının için özellikle uygundur. Gerçekten de, tüm bu teknikler (i) hassasiyeti (1 en çok kuru kütlesinin 10 µg.g-1 ), (ii) ölçüm aralığı Uzaysal çözünürlük ve (iii) çoklu öğe algılama açısından ilgili gereksinimlerini karşılamak. Bu özellikleri göz önüne alındığında, microbeam kimyasal element görüntüleme güçlü rutin görüntüleme teknikleri gibi tamamlayıcı olabilir optik ve floresan mikroskopisi. Bu iletişim kuralı, kültürlü hücreleri (U2OS) için titanyum dioksit nano tanecikleri maruz üzerinde nükleer microprobe çözümlemesi açıklar. Hücreleri büyümek zorundadır ve doğrudan bir özel olarak tasarlanmış örnek tutucu üzerinde optik mikroskop ve nükleer microprobe analiz aşamalarında maruz. Dalma-donma örnekleri kriyojenik fiksasyonu hücresel organizasyon ve kimyasal element dağıtım korur. (X-ışını emisyonu tarama iletim iyon mikroskobu, Rutherford spektrometresi gelmekte ve parçacık indüklenen) eşzamanlı nükleer microprobe analiz örnek üzerinde gerçekleştirilen hücresel yoğunluk, yerel dağıtım kılavuzu kimyasal elementlerin yanı sıra nano tanecikleri hücresel içeriği. Biyoloji, özellikle bağlamında ortaya çıkan Nanotoxicology ve kendisi için bizim anlama nano tanecikleri ve biyolojik örnekler arasındaki etkileşimler derinleştirdi gerekir Nanomedicine içinde böyle analitik araçlar için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Özellikle, nükleer microprobe analysis etiketli nano tanecikleri gerektirmez nanopartikül miktar ölçülebilir yüzey durumlarına bağımsız olarak bir hücre nüfus tek hücre düzeyine şunlardır.
Introduction
Hücresel homeostazı alımını kontrol, asimilasyon ve hücre içi yerelleştirme farklı iz elementler (iyonları, metaller, eksojen inorganik bileşikler) tarafından belirlenir. Bu bileşenleri sık sık izleri şeklinde vardır ama yine de sistem fizyolojisi önemli bir etkiye sahip. Böylece, normal ve patolojik/stresli durumlarda hücre Biyokimya hücresel metabolik mekanizmalar genel bir anlayış doğru bir anahtar adım çalışmadır. Bu nedenle, hücre içi kimyasal zenginliği, yapısal organizasyonu ve onların ilgili metabolik fonksiyonlar soruşturma etkinleştirme görüntüleme ve analitik yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde gerekli olur. Situ nicel parçası belirli bir örnek genel olarak kimyasal doğası ile ilgili bilgiler sağlamak mümkün çok az yöntemlerdir. Toplu form örnekleri analiz yöntemleri dışında in situ analizleri biyolojik örnekleri kendi integrality böylece (eser elementler ve iyonlarının) kurucu kimyasal koruma kitle ve yapısal bilgileri kaybetmeden düşünün ve proteinler. Nanobilimler geliştirmeye devam ederken, Ayrıca, Gelişmiş görüntüleme ve hücresel ölçekte çevre izlemek için analitik yöntem gözlemlemek ve nano-nesne davranışları ve etkileşimleri ölçmek için gerekli olacaktır. 1
Nano tanecikleri (NPs) en az bir yüz boyut aralığı 1 ile 100 nm sergilenmesi nesneler olarak tanımlandı. 2 belirli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, NPs, yaygın olarak sektöründe kullanılır. NPs biyo-uygulamaları ve nanomedicine istihdam edilmektedir. 3 , 4 NPs rağmen çok sayıda fizikokimyasal özellikleri ürettikleri bazı risklerin insan sağlığı ve çevre üzerinde olumsuz etkileri. Bu riskler uzun süreli ve tekrarlayan Etkilenmeler çeşitli konsantrasyon düzeylerde tarafından indüklenen ve bu değil henüz açıkça kurulmuştur. 5 , 6 , 7 , 8 özellikle, NPs kaderi hücreleri ve ilişkili hücresel yanıt içinde olan, bugüne kadar tam olarak açıklanan. Bu kısmen algılama izin yöntemleri kıtlığı ve miktar tek bir hücrede içselleştirilmiş NPS’nin kaynaklanmaktadır. 9
Nano tanecikleri hücresel doz olan microscopies, kütle spektrometresi (MS), tahmin etmek için kullanılan klasik analitik araçlar İndüktif eşleşmiş plazma MS (ICP-MS)10,11 ve sıvı Kromatografi MS (LC-MS), ama onlar sadece sağlamak yararlı bilgiler makroskobik ölçekte. Hiçbiri-in onları hücre altı NPs içerik ne de ayırma yöntemlerini kullanmaya gerek kalmadan NPs dağıtımını hassas bir değerlendirme sağlar. Doz-yanıt sistematik bir değerlendirme böylece atomik spektroskopi nükleer microprobe analiz12,13, sinkrotron x-ışını Floresans mikroskobu14 gibi temel yöntemleri aksine bu yöntemler ile imkansız ve ikincil iyon kütle spektrometresi (SIMS). 15 , 16 bu yöntemler özellikle ilginç Floresans mikroskobu kullanılarak yapılan gözlemler tamamlayıcı olarak, özellikle NPs floresan molekülleri ile Etiketlenmiş olamaz ve böylece yerel durumlarında incelenmektedir. NPs ile fluorophores, hatta aşılı bir dereceye kadar (i) miktar başına NP etiketleme düzeyi bilinmiyor ve (ii) NP yüzey kimyasal değişiklik hücresel dağılımı değiştirebilir çünkü zor kalır.
Bu makalede, morfoloji ve Majör, minör, biyolojik örneklerin elemental kompozisyon görüntüleme nişan nükleer microprobe teknikleri bir arada dayalı bir yöntem odaklanmak ve konsantrasyonları iz.
Nükleer microprobe analiz eser kimyasal elementler biyolojik dokularda ölçümü için özellikle uygun olmaktadır. Işın yanal çözünürlük (0.3-1 µm) ve kimyasal element algılama hassasiyeti (1-10 µg.g-1 kuru kitle) hücresel düzeyde çalışmalar için uygundur. Nükleer microprobe teknikleri (MeV enerjilerde genellikle çalışan) iyon demeti atomlar örnek mevcut etkileşim sonra yayılan parçacıklar algılama (fotonlar, elektronlar, iyonlar) temel alır. Hücrelerde meydana gelen etkileşimleri çoğu esas olarak: 1) uyarma/iyonlaşma atomların atom temel durumlarına geri; döndükten sonra bir foton emisyon tarafından takip ve 2) kendi enerji ve yönünü değiştirmek için önde gelen parçacıkların Difüzyon. Verilmiş parçacık enerji Main’i kimlik atomların etkileşimde yer alan ilgili ölçüm birimi. Eşleme öğelerinin gerçekleştirmek için iyon microbeam art arda örnek yüzey üzerinde kez yaklaşık 100 100 µm2 birkaç hücreyi içeren bir alanın üzerinde tarama yapılır. Verilmiş parçacıkları tespit edilir ve onların enerji her ışın pozisyon için kaydedilir. Partikül ışını konumuna göre sıralanması, böylece bu tür parçacıklar emisyon için sorumlu yapısı tanımlama veri tedavi amacı olduğunu. Burada, tam olarak Floresans mikroskobu ve nükleer microprobe analiz algılamak için yanı sıra yaşam ile NP etkileşimleri sonuçlarını araştırmak için hücresel ve alt hücresel ölçeklerde eksojen NPs ölçmek için temel alan bir yaklaşımı açıklamak sistemleri. Özellikle bu yöntem in situ miktar titanyum dioksit nano tanecikleri (TiO2 NPs) toplamları hücre altı düzeyinde açısından sunduğu fırsatlar üzerinde odaklanmak zorundadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz ne hücre altı düzeyinde özellikle diğer görüntüleme teknikleri ile mümkündür ötesinde yararlı bilgiler sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Görüntüleme yeteneğini yanı sıra, nükleer microprobe analiz de miktar biyolojik örnek kompozisyon girerek kimyasal elementlerin olanakları sunuyor. Mevcut çalışmada, biz insan hücre popülasyonlarının okudu ve aşağı seçilen bölge TiO2 için NPs maruz tek bir hücre temel ilgi analiz odaklı. Diğer teknikleri ile onun birlikte morf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Serge Borderes yönetmenlik ve video düzenleme için teşekkür ederiz. Fransız Ulusal araştırma ajansı araştırma programı TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01) destekler. CNRS ve entegrasyon etkinlik olarak Avrupa Topluluğu “destek genel ve endüstriyel araştırma kullanarak iyon ışın teknolojisi (ruhu)” EC sözleşme n ° 227012 altında sağlanan. Bu eser EC Sözleşme No 317169 altında Marie Curie eylemleri – bir “entegre etkinlik destekleyen yüksek lisans araştırma ile staj in sanayi ve eğitim Excellence” (SPRITE, D1.3) olarak ilk eğitim ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir. C’NANO Grand Sud Ouest ve bölge Aquitaine araştırma programı zehir-NANO (n ° 20111201003) ve araştırma programı POPRA (n ° 14006636-034) destekler.
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
