This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Et af de centrale spørgsmål i forståelse plantens udvikling er, hvordan enkelte celler opfører sig under orgel differentiering og vækst. Ideelt, cellulære hændelser, såsom genekspression mønstre og intracellulært protein lokalisering, kan ses i lyset af en større sammenhæng af vævet. Dette mål stiller tekniske udfordringer og kræver hele orgel observation med en høj rumlig samt tidsmæssig opløsning i længere perioder, som kan forårsage foto-toksiske virkninger. Da planterne hurtigt at tilpasse sig miljøændringer, skal vækstbetingelserne være tæt kontrolleret. For at gøre langsigtet billeddannelse uden at forstyrre den fysiologiske tilstand af anlægget, har tre ting, der skal sikres, 1) vækstbetingelser i prøvekammeret, 2) stabile prøve montering over lange perioder, og 3) imaging med lave lysintensiteter for at undgå foto-skader og ikke-fysiologiske betingelser.
Fysiologiske voksende conditions i mikroskopet prøvekammer er afgørende for langsigtede eksperimenter. Der er en række protokoller, der findes som beskriver billeddannende vækstkamre for konfokale mikroskoper 1 – 3. Men konfokal mikroskopi introducerer høj lys intensitet til anlægget, som kan forårsage stressreaktioner og normalt hæmmer væksten fire. Desuden fleste konventionelle mikroskoper tillader kun vandret positionering af prøven, hvilket ikke er optimalt for planter, da de forsøger at orientere sig og vokse i retning af vektor af tyngdekraften. I løbet af de seneste ti år har lys-ark mikroskopi opstået som et kraftfuldt værktøj til at fange udviklingen af store prøver på cellulær opløsning til tidsperioder på op til flere dage 5 – 9. Light-ark mikroskopi tillader positionering prøven lodret og bruges i stigende grad i planteforskning studere rodudvikling 10-21, for nylig revideret af Berthet og Maizel 22. Mange af de nævnte undersøgelser 10,13 – 18,21 blev optimeret og gennemført i laboratoriet af Ernst HK Stelzer ansætte en særlig måde at prøve montering karakteriseret ved voksende roden på overfladen af en gel 17. I disse undersøgelser blev en skræddersyet mikroskop anvendes, hvor planten holdes fra bunden. I modsætning hertil hovedparten af bredt tilgængelige lys-sheet mikroskoper holde prøven fra toppen. Således denne særlige fremstillingsmetode kan ikke let påføres. Metoden præsenteres her giver en protokol for den veletablerede på påbygning metode gælder for OpenSPIM 23, en åben adgang platform for at anvende og forbedre Selective Plane Illumination Mikroskopi (SPIM).
Det overordnede mål med denne protokol er at gøre det muligt for langsigtet billeddannelse af Arabidopsis rødder i OpenSPIM lys ark mikroskop. Dette opnås ved dyrkning af en plante oprejst på sverflade af en gel med rødderne i et flydende medium, mens bladene forbliver i luften. For at sikre fotosyntetiske aktivitet af anlægget, et skræddersyet belysningssystem lyser bladene, men ikke rødderne (figur 1).
Light Sheet Fluorescens Mikroskopi har den store fordel at kombinere lav fototoksicitet og ultrahurtig erhvervelse hastighed, som kan anvendes til at indfange et stort volumen med en høj spatio-temporale opløsning samtidig holde prøven i en fysiologisk tilstand. Løsningen af en lys plade mikroskop kan sammenlignes med et konfokalt mikroskop 9. Men lysspredning og absorption sker langs excitation og emission sti individuelt og den overordnede billedkvalitet kan være betydeligt lavere inde uigennemsigtige væv i forhold til overfladen. For at omgå denne komplikation man kan bruge muligheden for at rotere prøven langs den lodrette akse og observere den samme volumen fra forskellige retninger. Men dette er ikke altid en fordel, f.eks laterale rødder opstår på den ene side af roden og billedbehandling bagfra resulterer i en billedkvalitet lav uden at få mere information. Imidlertid kan rotationen skal fortrinsvis benyttes til at positionere Sample på den bedste måde. Den klassiske horisontale arrangement af de objektive linser giver mulighed for nye måder at prøve montering. Planter drage fordel af en lodret position. Præsenteres her, den "på overfladen af gelen" monterings metode har flere fordele i forhold til andre monteringsmetoder såsom indlejring roden indersiden af en gel 24,25. 1) Den rodsystemet er i direkte kontakt med det flydende medium. Prøvekammeret er forbundet til en perfusion system, som giver kontinuerligt frisk medium. Den kan også anvendes til hurtigt at udveksle hele volumenet af prøvekammeret at anvende forskellige medier eller narkotika. 2) Før prøveforberedelse planterne vokser som de er vant til at vokse i laboratorier. Planter kan vælges under et fluorescensmikroskop og behøver kun de ønskede planter, der skal fremstilles. 3) Anlægget overføres fra petriskålen til prøveholderen uden at blive rørt. Derved kan anlægget videreudvikle på samme gel det var stigende på i væksten incubatoR og mekanisk belastning er reduceret til et minimum. 4) syn på prøven er uhindret og optiske aberrationer minimeres fordi rummet mellem prøven og påvisning målet udelukkende fyldt med medium og ingen andre materialer med forskellige brydningsindeks.
For at udføre langsigtet billeddannelse, er nødvendigt belysningen plante for at sikre fotosyntetiske aktivitet af anlægget. I de fleste laboratorier planter vokser på en transparent gel, dvs. rødderne er udsat for lys. Dette kan medføre forskellige reaktioner på deres miljø og inducerer ændringer i deres biokemi og udvikling 26,27. For at reducere mængden af lys på rodsystemet blev sort plastfolie anvendes til at dække vandoverfladen samt et låg lavet af sort aluminiumfolie dækket prøvekammeret. Lys kan nå planternes blade igennem det centrale hul i låget. I denne opsætning var ingen stigning i baggrunden lys observeret, suggesting, at mængden af falsk lys fra de røde og blå lysdioder var signifikant reduceret med GFP filter og afskærmningsorganet tilgange. Dette tillod at holde lyset tændt under billedoptagelsen uden at øge kameraet baggrundsstøj.
Indehaveren Prøven er beregnet til 3D-print. valget af materiale er imidlertid afgørende, da adskillige plastmaterialer, der blev testet var ikke 100% stabil, hvilket resulterer i en forskydning af prøven. Derfor anbefales det at anvende harpikser stedet eller bygge prøveholderen ved formaling en polyethylen (PEP) stang. Ved brug af en lys ark mikroskop setup med dobbeltsidet belysningssystem prøveholderen kan forstyrre en af de lette plader afhængigt af rotationsvinklen. For at reducere mekanisk stress under øse planten fra pladen, bruge en flad vinkel spatel. Anlægget kan hurtigt tørre ud og erfaring luftstrøm for allerførste gang. Prøv at undgå enhver luft udkast (hurtige bevægelser, air-condition flow), work uafbrudt og skub holderen prøven i en 1000 uL pipettespids når det er muligt. Inde i mikroskopet, er det afgørende at ikke dyppe hele planten i flydende og holde bladene tørre.
Teknikken er ideel til billeddannelse tidlige stadier af lateral roddannelse. Når der udføres langsigtet billeddannelse af modne rodspidserne man skal huske på, at Arabidopsis rødder vokse med 100-300 um / h hurtigt ud af synsfeltet. En meget nyttig fremtidige gennemførelse kunne være en automatiseret sporing algoritme, som vil give efter rodspids vækst i længere tid. Evnen til at styre miljøforhold som lys og næringsstoffer sammensætning af mediet under købet proces tillader undersøge, hvordan planter tilpasse sig ændringer. Roden er i direkte kontakt med det flydende medium, som kan anvendes til at påføre lægemidler til kemisk aktivere genekspression, fx ved anvendelse af dexamethason-inducerbare 28- eller β-estradiol inducerbare system 29. Det tager imidlertid tid til at udveksle hele volumenet af prøvekammeret at udvaske et lægemiddel. Opsætningen kunne forbedres ved at minimere volumenet af prøvekammeret at accelerere mediumudskiftning. Ikke desto mindre er denne teknik har et stort potentiale. Kombinationen af stigende procedure, standardiserede dyrkningsforhold og den blide billedet købet ved hjælp af lys-ark mikroskopi tillader langtidsstudier af vegetabilsk udvikling med høj opløsning på en fysiologisk niveau. Dette vil hjælpe forskerne til at udforske fundamentale mekanismer i plantens udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Matyáš Fendrych for kritisk læsning / visning og Stephan Stadlbauer for lydudstyr. Takket være Miba Machine Shop på IST Østrig for deres bidrag til OpenSPIM. Den forskning, der fører til disse resultater har modtaget støtte fra Folkets programmet (Marie Curie-aktioner) i Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under REA tilskudsaftale nr [291.734] og Det Europæiske Forskningsråd (projekt ERC-2011 -StG-20101109-PSDP).
Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |