पौधे की जड़ों के प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक जेल की सतह पर बढ़ रहा है
Summary
This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
Abstract
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Introduction
समझ संयंत्र के विकास में महत्वपूर्ण प्रश्नों में से एक है कैसे एकल कक्षों अंग भेदभाव और विकास के दौरान व्यवहार करते हैं। आदर्श रूप में, सेलुलर घटनाओं, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और intracellular प्रोटीन स्थानीयकरण की तरह, ऊतक के एक व्यापक संदर्भ की रोशनी में देखा जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए तकनीकी चुनौतियों का बना हुआ है और एक उच्च स्थानिक साथ पूरे अंग अवलोकन करने के साथ ही समय की लंबी अवधि, जो तस्वीर विषाक्तता प्रभाव के कारण सकता है पर अस्थायी समाधान की आवश्यकता है। संयंत्रों के बाद से जल्दी से पर्यावरण परिवर्तन के लिए अनुकूल है, बढ़ती शर्तों कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए। आदेश संयंत्र की शारीरिक स्थिति के साथ हस्तक्षेप के बिना लंबे समय तक इमेजिंग करने के लिए, तीन बातें नमूना कक्ष में सुनिश्चित किया जाना चाहिए है, 1) बढ़ती शर्तों, 2) स्थिर नमूना समय की लंबी अवधि में बढ़ते, और 3) इमेजिंग कम प्रकाश तीव्रता के साथ तस्वीर क्षति और गैर-शारीरिक स्थितियों से बचने के लिए।
शारीरिक बढ़ रही conditiमाइक्रोस्कोप नमूना कक्ष में ons लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं। 3 – कि confocal सूक्ष्मदर्शी 1 के लिए इमेजिंग विकास कक्षों का वर्णन उपलब्ध प्रोटोकॉल का एक नंबर रहे हैं। हालांकि, confocal माइक्रोस्कोपी संयंत्र है, जो तनाव प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकता है के लिए उच्च प्रकाश तीव्रता का परिचय और आमतौर पर 4 विकास को रोकता है। इसके अलावा, सबसे पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी नमूना है, जो पौधों के लिए इष्टतम नहीं है, क्योंकि वे खुद को नई दिशा और गुरुत्वाकर्षण के वेक्टर की ओर बढ़ने की कोशिश की केवल क्षैतिज स्थिति की अनुमति। 9 – पिछले दस वर्षों में, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी कई दिनों से 5 तक की समय अवधि के लिए सेलुलर संकल्प पर बड़े नमूनों के विकास पर कब्जा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। लाइट-चादर माइक्रोस्कोपी स्थिति नमूना खड़ी की अनुमति देता है और तेजी से विकास जड़ 10 का अध्ययन संयंत्र अनुसंधान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है – 21, हाल ही में बर्थ द्वारा समीक्षाटी और Maizel 22। उल्लेख के अध्ययन 10,13 से कई – 18,21 अनुकूलित और अर्नस्ट एच Stelzer की प्रयोगशाला नमूना का एक विशेष तरीका रोजगार में आयोजित की गई एक जेल से 17 की सतह पर जड़ से बढ़ रहा है की विशेषता बढ़ते। इन अध्ययनों में, एक कस्टम बनाया माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया था, जिसमें संयंत्र के नीचे से आयोजित किया जाता है। इसके विपरीत, मोटे तौर पर उपलब्ध प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप के बहुमत के ऊपर से नमूना पकड़। इस प्रकार, इस विशेष तैयारी विधि आसानी से लागू नहीं किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत विधि अच्छी तरह से स्थापित ऑन-सतह बढ़ते विधि OpenSPIM 23, लागू करने और चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) को बढ़ाने के लिए एक खुला मंच का उपयोग करने के लिए लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य OpenSPIM प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप में Arabidopsis जड़ों की लंबी अवधि इमेजिंग के लिए सक्षम है। इस रों पर ईमानदार एक संयंत्र से बढ़ रही द्वारा पूरा किया हैएक तरल माध्यम में जड़ों के साथ एक जेल के urface जबकि पत्ते हवा में रहते हैं। आदेश संयंत्र के संश्लेषक गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए एक कस्टम बनाया प्रकाश व्यवस्था पत्ते नहीं बल्कि जड़ों (चित्रा 1) illuminates।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कम phototoxicity और ultrafast अधिग्रहण की गति है, जो है, जबकि एक शारीरिक स्थिति में नमूना रखने के लिए एक उच्च स्थानिक-सामयिक संकल्प के साथ एक बड़ी मात्रा में कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है गठबंधन करने के लिए महान लाभ है। एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप का संकल्प एक confocal खुर्दबीन 9 की तुलना की जा सकती है। हालांकि, प्रकाश बिखरने और अवशोषण को व्यक्तिगत रूप से उत्तेजना और उत्सर्जन मार्ग के किनारे होता है और समग्र छवि गुणवत्ता में काफी सतह की तुलना में अपारदर्शी ऊतकों के अंदर कम हो सकता है। इस जटिलता को नाकाम करने के लिए एक ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ नमूना बारी बारी से और अलग अलग दिशाओं से एक ही मात्रा का निरीक्षण करने की संभावना का उपयोग कर सकते हैं। लेकिन यह हमेशा फायदेमंद नहीं है, जैसे पार्श्व जड़ों अधिक जानकारी पाने के बिना जड़ और एक कम छवि गुणवत्ता में परिणाम के पीछे से इमेजिंग के एक तरफ उभरेगा। हालांकि, रोटेशन मुख्यतः samp की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासबसे अच्छा तरीका में ले। ऑब्जेक्टिव लेंस की क्लासिक क्षैतिज व्यवस्था नमूना बढ़ते के नए तरीके के लिए अनुमति देता है। पौधे एक ऊर्ध्वाधर स्थिति से लाभ। यहाँ प्रस्तुत बढ़ते विधि "जेल की सतह पर" इस तरह के एक जेल 24,25 के अंदर जड़ embedding के रूप में अन्य बढ़ते तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं। 1) जड़ प्रणाली तरल माध्यम से सीधे संपर्क में है। नमूना कक्ष एक छिड़काव प्रणाली है जो लगातार ताजा माध्यम प्रदान से जुड़ा है। यह भी तेजी से नमूना कक्ष की पूरी मात्रा का आदान-प्रदान करने के लिए विभिन्न मीडिया या दवाओं लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 2) नमूने के लिए पूर्व तैयारी पौधों को बढ़ने के रूप में वे प्रयोगशालाओं में विकसित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। पौधे एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे का चयन किया जा सकता है और केवल वांछित पौधों तैयार रहने की जरूरत है। 3) संयंत्र छुआ जा रहा बिना नमूना धारक को पेट्री डिश से स्थानांतरित कर रहा है। जिससे संयंत्र आगे एक ही जेल में यह विकास incubato में बढ़ रहा था पर विकसित कर सकते हैंआर और यांत्रिक तनाव एक न्यूनतम करने के लिए कम है। 4) नमूना पर देखें अबाधित है और ऑप्टिकल aberrations कम कर रहे हैं, क्योंकि नमूना और पता लगाने के उद्देश्य के बीच अंतरिक्ष के लिए पूरी तरह मध्यम और अपवर्तक सूचकांक भिन्न के साथ कोई अन्य सामग्री से भर जाता है।
आदेश में लंबे समय तक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, संयंत्र रोशनी प्रणाली संयंत्र के संश्लेषक गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। ज्यादातर प्रयोगशालाओं में पौधों को एक पारदर्शी जेल पर बड़े होते हैं, यानी जड़ों प्रकाश के संपर्क में रहे हैं। यह अपने पर्यावरण के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाओं का कारण है और उनकी जैव रसायन और विकास 26,27 में परिवर्तन लाती सकता है। आदेश जड़ प्रणाली पर प्रकाश की मात्रा को कम करने के लिए, काले रंग की प्लास्टिक की पन्नी पानी की सतह के साथ ही एक ढक्कन काले एल्यूमीनियम पन्नी से बना नमूना कक्ष कवर को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। लाइट संयंत्र तक पहुँच सकते हैं ढक्कन में केंद्रीय छेद के माध्यम से छोड़ देता है। इस सेटअप में, पृष्ठभूमि प्रकाश में कोई वृद्धि मनाया गया, suggestinछ है कि लाल और नीले एलईडी से आवारा प्रकाश की मात्रा काफी GFP फिल्टर और छायांकन दृष्टिकोण की कमी थी। इस कैमरे पृष्ठभूमि शोर में वृद्धि के बिना प्रकाश छवि अधिग्रहण के दौरान चालू रखने की अनुमति दी।
नमूना धारक 3 डी मुद्रण के लिए बनाया गया है। हालांकि, सामग्री का चुनाव महत्वपूर्ण है के रूप में कई प्लास्टिक कि परीक्षण किया गया नमूने की एक बहाव में जिसके परिणामस्वरूप 100% स्थिर थे। इसलिए, यह बजाय रेजिन का उपयोग करें या एक पॉलीथीन (पीईपी) रॉड मिलिंग द्वारा नमूना धारक का निर्माण करने की सिफारिश की है। दो तरफा रोशनी प्रणाली के साथ एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग करते नमूना धारक रोटेशन कोण के आधार पर प्रकाश चादरों से एक के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। थाली से संयंत्र scooping के दौरान यांत्रिक तनाव को कम करने के लिए, रंग के एक फ्लैट कोण का उपयोग करें। संयंत्र जल्दी बाहर सूखी और बहुत पहले समय के लिए हवा का प्रवाह अनुभव कर सकते हैं। किसी भी हवाई मसौदा (रैपिड आंदोलनों, हवा हालत प्रवाह) से बचने के लिए प्रयास करें, woआरके uninterruptedly और एक 1000 μL pipet टिप में नमूना धारक स्लाइड जब भी संभव है। माइक्रोस्कोप के अंदर, यह तरल में पूरे संयंत्र डुबकी और न पत्तियों को सूखा रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
तकनीक पार्श्व जड़ गठन के प्रारंभिक दौर इमेजिंग के लिए आदर्श है। जब परिपक्व जड़ सुझावों की दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदर्शन एक को ध्यान में रखना चाहिए कि Arabidopsis जड़ों तेजी से 100-300 मीटर / ज के साथ बढ़ने देखने के क्षेत्र से बाहर है। एक बहुत ही उपयोगी भविष्य कार्यान्वयन एक स्वचालित ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म, जो समय की लंबी अवधि में निम्नलिखित जड़ टिप विकास की अनुमति होगी हो सकता है। अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान इस तरह के प्रकाश और मध्यम के पोषक तत्व संरचना के रूप में पर्यावरण की स्थिति को नियंत्रित करने की क्षमता की जांच कैसे पौधों बदलाव के लिए अनुकूल है। जड़ inducible 28 dexamethasone या β-ESTR का उपयोग कर उदाहरण के लिए, तरल माध्यम है, जो रासायनिक जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए दवाओं लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ सीधे संपर्क में हैinducible प्रणाली 29 adiol। हालांकि, यह नमूना कक्ष की पूरी मात्रा का आदान-प्रदान करने के लिए एक दवा बाहर धोने के लिए समय लगता है। सेटअप मध्यम आदान-प्रदान में तेजी लाने का नमूना कक्ष की मात्रा कम करके सुधार किया जा सकता है। फिर भी, इस तकनीक के लिए एक महान क्षमता है। बढ़ते प्रक्रिया, मानकीकृत बढ़ती शर्तों और सौम्य छवि अधिग्रहण प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का उपयोग के संयोजन एक शारीरिक स्तर पर उच्च संकल्प के साथ संयंत्र के विकास के लंबे समय तक अध्ययन की अनुमति देता है। यह शोधकर्ताओं मदद संयंत्र के विकास के मौलिक तंत्र का पता लगाने के लिए होगा।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऑडियो उपकरणों के लिए महत्वपूर्ण पढ़ने / देखने के लिए Matyas Fendrych और स्टीफ़न Stadlbauer धन्यवाद। OpenSPIM के लिए उनके योगदान के लिए IST ऑस्ट्रिया में Miba मशीन शॉप के लिए धन्यवाद। अनुसंधान इन परिणामों के लिए अग्रणी वजह अनुदान समझौते n ° [291734] और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी परियोजना -2011 के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) के लोग कार्यक्रम (मैरी क्यूरी प्रक्रिया) से धन प्राप्त हुआ है -StG-20101109-PSDP)।
Materials
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
References
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