의 재배<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 실험실에서 세 가지 차원에서

요약

우리는 NGT-3D 및 NGB-3D라는 3D 선충 재배 시스템을 구축하는 간단한 방법을 제시한다. 이러한 표준 2D 실험실 C. elegans의 배양 플레이트보다 자연 예쁜 꼬마 선충 서식지에 더 유사 서식지에서 선충의 체력과 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

Caenorhabditis elegans와 같은 유전자 모델 유기체의 사용은 지난 50년 동안 생물학에서 중요한 발견으로 이어졌습니다. 예쁜꼬마선충에 대해 우리가 알고 있는 대부분의 정보는 선충의 실험실 배양에 국한되어 있으며, 이는 선충이 자연에서 일반적으로 서식하는 환경을 반드시 반영하지 않을 수도 있습니다. 벌레가 썩은 과일과 자연의 식물 퇴비에서 만나는 3D 매트릭스와 더 유사한 3D 서식지에서 예쁜꼬마선충을 재배하면 2D에서 관찰되지 않는 새로운 표현형과 행동을 밝힐 수 있습니다. 또한 3D 실험은 2D에서 관찰되는 표현형이 자연의 벌레와 어떤 관련이 있는지 설명할 수 있습니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans)이 3차원으로 정상적으로 성장하고 번식하는 새로운 방법을 제시합니다. Nematode Growth Tube-3D(NGT-3D)에서 예쁜꼬마선충을 배양하면 3D 환경에서 예쁜꼬마선충 균주 또는 다양한 조건의 생식 적합성을 측정할 수 있습니다. 또한 현미경 분석을 위해 예쁜꼬마선충을 3D로 배양하기 위해 Nematode Growth Bottle-3D(NGB-3D)라는 새로운 방법을 제시합니다. 이러한 방법을 통해 과학자들은 자연에서 만나는 환경을 더 잘 반영하는 조건에서 예쁜꼬마선충의 생물학을 연구할 수 있습니다. 이것들은 우리가 실험실에서 관찰하는 예쁜꼬마선충의 생리학과 행동의 근본적인 진화적 관련성을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서론

실험실에서의 선충 Caenorhabditis elegans에 대한 연구는 지난 50년 동안 생물학 분야에서 중요한 발견으로 이어졌습니다¹. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 1998년에 게놈 염기서열 분석을 한 최초의 다세포 유기체였으며, 전체 유기체의 발달, 생리학 및 행동에 대한 개별 유전자의 기여를 이해하는 데 매우 중요했습니다. 과학자들은 이제 이러한 유전자가 자연 환경에서 유기체의 생존과 생식 적합성에 어떻게 기여할 수 있는지 더 깊이 이해하기 위해 유전자 수준^3-5에서 생태학과 진화에 대해 질문하고 있습니다.

C. elegans는 다시 한 번 이러한 질문에 답할 수 있는 훌륭한 시스템을 제공할 수 있습니다. 그러나 자연 선충 서식지에서 예쁜꼬마선충의 생물학에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 현재 실험실에서 예쁜꼬마선충의 통제된 자연 조건을 시뮬레이션할 수 있는 방법은 없습니다. 실험실에서 C. elegans는 E. coli 박테리아⁶이 뿌려진 한천 판의 표면에서 배양됩니다. 그러나 자연에서는 예쁜꼬마선충(C. elegans

프로토콜

1. NGT-3D 및 NGB-3D를위한 솔루션을 준비

1. 다음 멸균 솔루션을 준비 : 0.1454 M NaCl 용액 1 L, 1 M _CaCl2를, 1 M _황산 1 L 1 L, 원성 국물 (LB), KH _2의 1 M KPO ₄ 버퍼 (108.3 g 1 L PO ₄ 및 K ₂ 35.6 g HPO _4, H ₂ O 기입 L 1). 이러한 솔루션을 사용 NGM의 제조 이전 프로토콜 ^(10)에서 찾을 수있다.
2. 121 ° C, 15 분에서 오토 클레이브 솔루션을 제공합니다.
3. 멸균 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤 용액 50 ㎖를 준비합니다. 한 50㎖ 원추형 튜브에 콜레스테롤의 0.25 g 및 99.99 % 에탄올 50ml를 혼합하고 잘 혼합한다. 오토 클레이브하지 마십시오. 0.45 μm의 주사기 필터로 50 mL를 주사기를 사용하여 콜레스테롤을 살균 용액. 이것은 또한 어떤 용해되지 않은 콜레스테롤을 제거합니다.
4. 2'- 데 옥시 -5- fluorouridine (FUdR) 주식의 150 mM의 10 ㎖를 준비합니다 (선택 사항)....

결과

NGT도 3d의 구조는 한천 (도 1a)에 걸쳐 이격 된 작은 박테리아 콜로니 한천 채워진 시험관 결과 단순하고 간단한 프로토콜이다. 웜 자유롭게 세균성 식민지를 발견하고 소비, 한천 매트릭스를 통해 이동할 수 있습니다. C. elegans의 재현과 NGT-3D 정상적으로 성장할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 다산과 표준 2D NGM 플레이트와 3D의 애벌레 개발을 비교 하였다. 상대 무리 크기 분석에서, 성인 C. 세균 식민지가 적어도 60 식민지 (그림 1B)와 풍부한 경우 NGT-3D로 자웅 동체 표준 2D NGM 판에있는 자웅 동체로 단지뿐만 아니라 재생 엘레 간스. 또한, NGT-3D의 애벌레 개발도 96시간 (그림 1C) 후 성인 상태에서 웜의 대부분과 세균성 식민지의 많음이있을 때 일반적으로 진행된다. 그러나.......

토론

고전 선충류 성장 미디어 판을 사용하여 선충의 실험 재배가 제공 한 C. elegans의에서 연구 중요한 발견의 수백에 매우 중요했다. 여기, 우리는 더 정확하게 자연 입체 서식지를 반영하는 환경에서 C. 엘레을 육성하기 위해 새로운 방법을 제시한다. 다른 방법 3D ¹³ C. 엘레을 관찰하기 위해 사용되었지만, 이는 고체 차원 매트릭스 웜의 재배를 허용하는 제 1 프로토콜이다. 여기에 표시된 두 가지 방법, NGT-3D 및 NGB-3D는 과학자 이미지도 3D 재배 피트니스, 발전과 성장의 문제 등을 요청하고 3D로 벌레를 기록 할 수 있습니다. NGT-3D 및 NGB-3D 표준 2D NGM 플레이트에 약간의 차이가 있지만, 그들은이 원래의 방법과 유사한 만 z 축에 웜 재배를 추가하도록 조정한다. 따라서, 우리는 개발, 불임 및 수명이 우리의 조건에서 정상적으로 진행 것을 찾을 수 있습니다. 그만큼목표는 실험실 연구를 위해 사용 할 수있는 프.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB 국물, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
염화나트륨	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
한천, 과립	Difco	214530
펩톤	Bacto	211677
염화칼슘, 이수화물	바이오 베이직	CD0050	2 * H 2 < / sub>O; 147.02 MW
콜레스테롤	바이오 베이직	CD0122	386.67 MW
에틸 알코올	B & J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
마그네슘 설페이트, 무수	바이오 베이직	MN1988	120.37 MW
인산칼륨, 모노베이직, 무수	바이오 베이직	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	도쿄 화학 산업	D2235	246.19 MW
인산칼륨, 이염기성, 무수	바이오 베이직	PB0447	174.18 MW
다목적 시험관	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
시험관 마개	Stockwell Scientific	ST.8575
세포 배양 플라스크	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research 스테레오 현미경	Nikon	SMZ18
고화질 컬러 카메라 헤드	Nikon	DS-Fi2
PC 기반 제어 장치	Nikon	DS-U3
NIS 요소 기본 연구, 현미경 이미징 소프트웨어	Nikon	MQS32000