Dextran effektiviserer Lentiviral transduktion af Murine og menneskelige primære NK-celler
Summary
Målet med denne undersøgelse var at formulere teknologier, der muliggør vellykket gen transduktion i primære natural killer (NK) celler. Dextran-medieret lentiviral transduktion af menneskelige eller musen primære NK celler resultater i højere gen expression effektivitet. Denne metode af genet transduktion vil langt forbedre NK celler genetisk manipulation.
Abstract
Den effektive transduktion af specifikke gener i natural killer (NK) celler har været en stor udfordring. Vellykket transductions er afgørende for definitionen af gen interesse for udvikling, differentiering og funktion af NK celler. De seneste fremskridt i forbindelse med kimære antigen receptorer (biler) i cancer immunterapi fremhæve behovet for en effektiv metode til at levere udefrakommende gener til effektor lymfocytter. Effektiviteten af lentiviral-medieret gen transductions til primære menneskelige eller mus NK celler forbliver betydeligt lav, hvilket er en stor begrænsende faktor. De seneste fremskridt ved hjælp af kationiske polymerer, såsom polybrene, vise en forbedret gen transduktion effektivitet i T-celler. Disse produkter blev dog ikke bedre transduktion effektivitetsgevinster af NK celler. Dette arbejde viser, at dextran, en forgrenet glucan polysaccharid, væsentligt forbedrer transduktion effektivitet af menneskelige og musen primære NK celler. Denne meget reproducerbare transduktion metode giver en kompetente værktøj for transducing menneskelige primære NK celler, som kan langt bedre klinisk gen sikkerhedsudvidede programmer og dermed NK cellebaserede cancer immunterapi.
Introduction
Natural killer (NK) celler er den største lymfatisk befolkning af medfødte immunsystem1. NK-celler fungerer som first-line forsvarere af vært immunrespons mod tumorer og infektioner2,3,4. NK-celler også spille en central rolle i udviklingen af tolerance gennem udskillelsen af potente cytokiner og kemokiner5. På grund af deres potent evne til at målrette og fjerne tumorceller, er flere kliniske forsøg gennemføres for at vurdere donor-stammer menneskelige NK celler som en adoptive immunterapi for kræft6,7. I modsætning til T-celler endnu NK-celler udviklingsmæssige biologi ikke være godt karakteriseret8. Dette manglende kendskab er delvist på grund af manglende effektive teknikker, der levere gener af interesse til musen eller menneskelige primære NK celler. Af disse grunde, er de fleste NK-celle undersøgelser blevet gennemført i cellelinjer og ikke i primærelementer. Behovet for en pålidelig og effektiv protokol til transduce primære NK celler med gener af interesse er derfor afgørende.
Det overordnede mål med denne undersøgelse var at formulere en konsekvent og pålidelig metode som primære menneskelige eller murine NK celler kunne være transduced med lenti- eller retrovira.
Tidligere undersøgelser, som har forsøgt at løse dette problem er blevet udført, i vid udstrækning benytter den forbigående omdannelse af primære NK celler. Dette omfatter plasmid Transfektion9,10, Epstein – Barr Virus (EBV) / retroviral hybrid vektor11, vaccinia vektorer12,13, og Ad5/F35 kimære adenoviral vektorer14. Trods den beskedne effektivitet af disse teknikker gør transduktion forbigående karakter dem uegnet til den langsigtede udnyttelse af genetisk modificeret NK celler. Nogle nylige undersøgelser har brugt retroviral vektorer til transduce NK celler, der kræver flere cyklusser af infektion at opnå et acceptabelt niveau af gen expression11,15. I modsætning til retroviral vektorer, kan lentiviral vektorer bruge vært-celle nukleare import maskiner til translocate viral pre integration komplekset ind i kernen. Dette er en stor begrænsende faktor i replikering af virus i ikke-dividere celler, som omfatter primær NK celler.
Interaktioner mellem forskellige celle-overflade receptorer og viruspartikler tillade viral udbredelse ind i cellen. De første sammenstød mellem de virale kuvert proteiner og deres beslægtet vært receptorer kunne være begrænset på grund af de potentielle negative afgifter mellem disse to. Rationalet bag mange transduktion teknikker er, at tilsætning af kationiske polymerer, såsom polybrene (Pb), protamine-sulfat (PS) eller dextran, kan give en positiv ladning på celle-overflade receptorer og dermed øge bindingen af virale kuvert proteiner. Dette vil øge fusion effektivitet og udbredelsen af de virale partikler af celler16. Selv om det er blevet rapporteret, at Pb eller PS kan forbedre genoverførsel i T celler17, har deres program ikke nogen effekt i transduktion effektiviteten af primære NK celler. Desuden en komparativ analyse mellem disse reagenser ved hjælp af primære NK celler ikke er blevet udført. I denne undersøgelse, blev transduktion effektiviteten af de tre kationiske polymerer sammenlignet. Resultaterne viser, at blandt disse tre kationiske polymerer, kun dextran betydeligt forbedrer effektiv viral signaltransduktion i både mus og menneskelige primære NK celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse viser at brugen af dextran som en kationiske polymer agent effektiviserer lentiviral transduktion af både murine og menneskelige primære NK celler. Derudover har andre kationiske stoffer, såsom Pb eller PS, nogen mærkbar virkning på levering af virale vektorer i menneskelige primære NK celler. Det er tidligere påvist, at Pb kan forøge gen transduktion i human T celler17. Disse resultater tyder imidlertid på at hverken Pb eller PS har en lignende effektivitet på mennes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Lucia Sammarco og hendes Lulu limonade stå for inspiration, motivation og støtte. Dette arbejde blev støttet i en del af NIH R01 AI102893 og NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); Programmet HRHM MACC fondens (S.M.; S.R.; M.S.T); Nicholas Family Foundation (S.M.); Gardetto familie (S.M.); Hyundai lærde Program (M.S.T.); Hyundai håb på hjul (S.R.); MACC fond (M.S.T. og S.M.); children’s Research Institute, MCW (S.R.); og Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
