Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상
Summary
이 연구의 목표는 기본 자연적인 살인자 (NK) 세포에서 성공적인 유전자 변환에 대 한 허용 하는 기술을 공식화 했다. 인간의 lentiviral 변환 dextran 중재 또는 더 높은 유전자 식 효율성에 마우스 기본 NK 세포 결과. 이 방법은 유전자 변환의 NK 세포 유전자 조작을 향상 방대 하 게 됩니다.
Abstract
자연적인 살인자 (NK) 세포에 특정 유전자의 효율적인 변환 주요 도전 하고있다. 성공적인 transductions는 개발, 차별화, 및 NK 세포의 기능에 관심사의 유전자의 역할을 정의 하는 데 중요 합니다. 암 immunotherapy에 공상 항 원 수용 체 (자동차)에 관련 된 최근의 진보 effector 세포에 세 유전자를 전달 하는 효율적인 방법에 대 한 필요성을 강조 합니다. 기본 인간 또는 마우스 NK 세포 중재 lentiviral 유전자 transductions의 효율성 유지 크게 낮은 주요 제한 요인입니다. 최근 진보 양이온 중합체, polybrene, 등을 사용 하 여 T 세포에서 향상 된 유전자 변환 효율을 표시 합니다. 그러나, 이러한 제품 NK 셀의 변환 효율을 개선 하지 못했습니다. 이 작품 보여줍니다 그 dextran, 분기 글 루 칸 다 당 류, 크게는 인간의 변환 효율 및 마우스 기본 NK 세포 향상 됩니다. 이 높은 재현성 변환 방법론 인간의 기본 NK 세포, 임상 유전자 배달 응용 프로그램 및 따라서 NK 세포 기반 암 immunotherapy. 훨씬 향상 시킬 수 있는 시험을 위한 유능한 도구를 제공 합니다.
Introduction
자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 시스템1의 주요 림프모구 인구. NK 세포는 종양과 감염2,,34에 대 한 호스트 면역 반응의 첫 번째 라인 수비수로 작동합니다. NK 세포는 또한 발산5와 강력한 cytokines의 분 비를 통해 관용의 개발에 중심 역할을 한다. 종양 세포를 대상으로 그들의 강력한 능력으로 인해 여러 임상 시험 암6,7에 대 한 입양 immunotherapy로 인간 NK 세포 기증자 파생 된을 평가 하기 위해 실시 되고있다. 달리 T 세포, NK 세포의 발달 생물학이 있다 아직 잘 특징8. 지식의이 부족은 부분적으로 마우스 또는 인간의 기본 NK 세포의 유전자를 전달 하는 효율적인 기술의 부재 때문입니다. 이러한 이유로 대부분의 NK 세포 연구 1 차 셀 대신 셀 라인에서 실시 되었습니다. 따라서, 안정적이 고 효율적인 프로토콜 transduce 기본 NK 세포의 유전자에 대 한 필요성은 중요 합니다.
이 연구의 전반적인 목표는 기본 인간 또는 murine NK 세포 lenti-또는 레트로 바이러스 불리고 수 있는 일관 되 고 신뢰할 수 있는 방법을 공식화 했다.
이 문제를 해결 하려고 하는 이전 연구, 크게 기본 NK 세포의 과도 변화를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 플라스 미드 transfection9,10, 엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 포함 / 하이브리드 retroviral 벡터11, vaccinia 벡터12,13및 Ad5/F35 공상 adenoviral 벡터14. 이러한 기술의 겸손 한 효율성에도 불구 하 고 변환의 과도 특성은 그들이 유전자 변형된 NK 세포의 장기 활용에 적합 합니다. 몇 가지 최근 연구 transduce NK 세포, 감염 유전자 표현11,15의 수락 가능한 수준을 달성 하기의 여러 주기를 요구를 retroviral 벡터를 사용 했습니다. Retroviral 벡터, 달리 lentiviral 벡터는 바이러스 사전 통합 복잡 한 핵으로 이동 하 호스트 세포 핵 가져오기 기계를 사용할 수 있습니다. 이것은 기본 NK 세포를 포함 하는 비 분열 세포에서 바이러스의 복제에 주요 제한 요소 이다.
다른 세포 표면 수용 체와 바이러스 성 입자 사이 상호 작용 셀으로 바이러스 성 통풍 관을 허용합니다. 바이러스 성 봉투 단백질 및 그들의 동족 호스트 수용 체 사이의 초기 계약이 두 가지 사이의 기존 잠재적인 부정적인 요금 때문에 제한 될 수 있습니다. 많은 변환 기법 뒤에 근거는 polybrene (Pb), protamine 황산 (PS), 등 dextran, 양이온 중합체의 세포 표면 수용 체에 포지티브 차지를 줄 수 있고 그로 인하여 증가 바이러스 성 봉투의 바인딩 단백질입니다. 이 셀16퓨전 효율성과 바이러스 성 입자의 통풍 관을 증가할 것 이다. Pb 또는 PS 향상 시킬 수 있는 T 세포17에 유전자 이동으로 보고 되어, 그들의 응용 프로그램 없 어떤 효과 기본 NK 셀의 변환 효율에서. 또한, 기본 NK 세포를 사용 하 여 이러한 시 약 사이의 비교 분석 하지 수행 되었습니다. 이 연구에서는 3 개의 양이온 중합체의 변환 효율성 비교 되었다. 결과,이 3 개의 양이온 폴리머 중 dextran만 크게 향상 마우스 및 인간의 기본 NK 세포로 효율적인 바이러스 성 변환 보여.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 양이온 폴리머 에이전트 murine 및 인간의 기본 NK 세포의 lentiviral 변환 효율 향상 dextran의 사용 하는 보여줍니다. 또한, 다른 양이온 대리인, Pb 등 PS, 아무 인지할 수에 영향을 바이러스 성 벡터의 기본 인간 NK 세포에. 이전에, Pb 인간 T 세포17에 유전자 변환 증가 수 있습니다 입증 되었습니다. 그러나 이러한 결과, Pb도 PS 기본 인간 NK 세포에 비슷한 효율을가지고 제안. 이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 루시아 Sammarco와 그녀의 룰 루의 레모네이드 스탠드 영감, 동기 부여, 및 지원을 위한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 AI102893와 NCI R01 CA179363 (S.M.);에 의해 부분적으로 지원 NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); 알렉스 레모네이드 스탠드 재단 (S.M.); MACC 기금 (S.M.;의 HRHM 프로그램 S.R.; M.S.T); 니콜라스 가족 재단 (S.M.); Gardetto 가족 (S.M.); 현대 학자 (M.S.T.) 프로그램; 바퀴 (S.R.);에 현대 희망 MACC 기금 (M.S.T. 및 S.M.); 어린이 연구소, MCW (S.R.); 그리고 캐시 Duffey Fogerty 수상 (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
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