We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Den soft-agar overlegg teknikken ble opprinnelig utviklet over 70 år siden og har vært mye brukt i flere områder av mikrobiologisk forskning, herunder arbeid med bakteriofager og bakteriociner, protein antibakterielle midler. Denne tilnærmingen er relativt billig, med minimal ressursbehov. Denne teknikken består av spotting supernatant fra en donor-stamme (potensielt huse en toksisk forbindelse (e)) på en størknet bløt agar overlegg som er podet med en bakterieteststammen (potensielt følsomme for den giftige forbindelse (e)). Vi benyttet denne teknikken for å screene et bibliotek av Pseudo syringae stammer for intraspesifikk drapet. Ved å kombinere denne tilnærming med et utfellingstrinn og målrettede gendelesjoner, kan flere toksiske forbindelser fremstilt ved samme belastning bli differensiert. De to antagonistiske midler som vanligvis utvinnes ved hjelp av denne teknikken er bakteriofager og bakteriociner. Disse to midler kan differensieres ved hjelpto enkle ytterligere tester. Utføre en seriell fortynning på en supernatant inneholder bakteriofag vil resultere i individuelle plakk blir mindre i antall med større fortynning, mens serie fortynning av en supernatant inneholder bakteriosin vil medføre en lysning sone som blir jevnt mer grumset med større fortynning. I tillegg vil en bakteriofag frembringe en tømmesone når prikket inn på en ny myk agar overlegg sådd med den samme belastning, mens et bakteriocin ikke vil produsere en tømmesone når den overføres til en frisk myk agar plen, på grunn av fortynning av bakteriocin.
Nylig har det vært betydelig interesse for å utvide vår forståelse av mikrobiell økologi (spesielt microbiomes i ulike miljøer), samt nye antibakterielle forbindelser til bruk i kampen mot antibiotikaresistente patogener 1,2. En sammenhengende tema mellom disse interessene er å forstå antagonistiske interaksjoner mellom bakteriestammer i sitt naturlige miljø. Det er mange måter som bakterier antagoniserer konkurrenter 3. Bakteriociner, en mangfoldig gruppe av protein, antibakterielle forbindelser, har lenge blitt studert for sin rolle som formidler interbacterial antagonisme, med to av de mest studerte artene blir Pseudomonas aeruginosa 4,5 og Escherichia coli 6, viktige menneskelige patogener. I tillegg til bakteriociner, kan induserte prophages også fungere som anticompetitor agenter, slik at en belastning å invadere i en nisje som allerede er kolonisert 7. Pseudo syringae er en plante patogen er kjent for å fremstille en rekke antimikrobielle midler, blant annet enkelt protein bakteriociner 8, bakteriofag hale-avledede bakteriociner 9 (betegnet tailocins), så vel som ikke-proteinholdige sekundære metabolitter 10. Nylig har det vært interesse for å forstå hvordan disse antimikrobielle stoffer påvirker økologien i denne organismen, samt hvordan de kan bli brukt til å kontrollere plantesykdommer 11.
En mye anvendt metode for å studere både bakteriociner og bakteriofag er den myk-agar overlegg teknikk. Denne metoden ble først beskrevet av Gratia i 1936 for å hjelpe til opplisting bakteriofag 12,13.
Her beskriver vi anvendelse av soft-agar overlegg metode, i kombinasjon med målrettet genetisk manipulasjon og polyetylenglykol (PEG) utfelling, for å skille mellom tre forskjellige antimikrobielle midler (en bakteriofag, et høymolekylært bacteriocin, og en lav molekylvekt bakteriocin) produsert av en enkelt bakteriestamme. Fordelen med denne tilnærmingen er at det er relativt enkelt og billig, og det er derfor, til tross for at det er desidert "low-tech", det er fortsatt mye brukt.
Den soft-agar overlegg teknikken beskrevet her har blitt mye brukt i mange tiår av forskere som er interessert i bakteriofager eller bakteriociner. De viktigste fordelene med denne tilnærmingen er at det er enkelt, billig og relativt lett å tolke. Ved å kombinere soft-agar overlegg med PEG utfelling og seriell fortynning, kan antimikrobielle midler separeres i høy sammenlignet med lavmolekylære stoffer, og replikative vs. ikke-replikative midler (dvs. bakteriofag vs. tailocin, henholdsvis). Endelig kan inkorporering av målrettet genetisk manipulasjon (sletting og komplemente) av antatte bakteriocinkomponenten eller profag loci fast etablere identiteten til en gitt antagonistisk sammensatte. Vi har nylig brukt denne metoden for å beskrive en ny bakteriofag-avledet bacteriocin utbredt blant Pseudo syringae stammer 9.
Vekstmedier og betingelser som er angitt i denne protokollen fungerer godt for Pseudo syringae og vil sannsynligvis være tilstrekkelig for andre Gram-negative bakterier som vokser kraftig under disse betingelser. Imidlertid vil forskerne ved hjelp av denne metode vil optimalisere timing, kulturmediet, induksjonsmetode, og inkubering temperatur i deres system. De kritiske parametrene omfatter indusering av den produserende kultur, mens i den logaritmiske vekstfase, i tillegg til poding av soft-agar overlegg med tilstrekkelig logaritmisk fase kultur for å sikre en jevn fordeling bakterie, men ikke overdreven kultur, som vil skjule eventuelle rensesonene. Det er mange bakteriociner som ikke er indusert som en del av SOS respons, men snarere blir indusert gjennom peptid-baserte quorum følersystemer (spesielt grampositive bakteriociner 15), og dermed kan en forsker ønsker å screene flere forskjellige metoder for igangsetting (for eksempel modifiserende næringsinnholdet i-induserende medium, eller slik at for forlenget inkubering av den produserende stamme).
når du brukerdenne teknikken, må det soft-agar legget være grundig smeltes og holdes ved 55-60 ° C før tilsetningen av den seeding belastning. Vi har hatt flere forsøk hvor soft-agar ikke ble grundig smeltet (selv om visuelt det syntes å være), og resulterte i et overlegg med et kornete utseende. Resultater fra et kornete overlegg kan likevel være generelt tolkbare, men dette er avhengig av styrken av inhibering (svakere hemming vil være mer vanskelig å observere). En endelig, som forvirret variabel for å vurdere ved bruk av denne teknikk er at temperaturen av den smeltede agar tillates tilstrekkelig tid til å avkjøles før inokulering med podestamme, slik at man unngår å drepe seeding belastning. For å unngå dette problemet, sikrer vi soft-agar er varmt, men ikke varmt, å berøre. Langs disse linjene, har vi også observert at hvis vi gir utilstrekkelig tid for en seeding kultur for å akklimatisere seg til den smeltede agar, før helle overlegg, gjenopprette vi generelt dårlig bakteriell growth, som gjør tolkingen av spesifikk hemming vanskelig eller umulig å tolke. Dette er grunnen til at vi lar 10-15 ekstra sekunder inkubasjon mellom virvling og helle overlegg. Avveiningen mellom å opprettholde agar i en helt smeltet tilstand (varmere er bedre), men ikke dødelig for seeding stamme (varmere er ikke bedre) er en som sannsynligvis vil trenge å bli bestemt av en forsker gjennom prøving og feiling.
Hvis en PEG utfellingstrinn blir brukt, ville det være fordelaktig å inkludere en negativ kontroll hvor et sterilt medium medium er behandlet identisk til kultursupernatanten. Dette vil sikre at det å drepe-aktivitet er ikke et resultat av gjenværende PEG eller kloroform i prøven supernatanten.
Ettersom begge bakteriofager og bakteriociner tendens til å være meget spesifikk, er det ikke uvanlig å støte på noen åpenbar drepende aktivitet med en gitt kombinasjon av stammer. Dette kan resultere fra en variasjon av stamme-spesifikke gjenmotstandsmekanismer, en er at teststammen enten mangler eller har en ukjent versjon av reseptoren som trengs for målretting av en gitt bakteriosin eller bakteriofag.
En alternativ metode, har bakteriocinet screeningsmetoden er beskrevet av Kawai et al. , Men lider av ulemper og har ikke vært allment vedtatt 16. Konkret krever denne teknikken observere buljong prøver i tidsintervaller som kan være tyngende, og tillater ikke for diskriminering mellom bakteriofag-avledet og bakteriocinløsning-avledet draps aktiviteter.
De viktigste begrensninger i denne teknikk er at det ikke er godt egnet for organismer som ikke vokser robust (og dermed vil mangler lett skillbare rensesonene) eller som havn prophages eller bakteriociner som ikke er robust fremstilt under laboratorieforhold. Tilpassing av denne teknikken til å oppdage bakteriosinene produsert i miljøprøver vil både utvide verktøyetav denne teknikken, og legge til rette for større innsikt i rollen som bakteriociner innenfor naturlige innstillinger.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |