We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Mjuk-agar teknik utvecklades ursprungligen över 70 år sedan och har använts i stor utsträckning i flera områden av mikrobiologisk forskning, inklusive arbete med bakteriofager och bakteriociner, protein antibakteriella medel. Detta tillvägagångssätt är relativt billigt, med minimala krav på resurser. Denna teknik består av spotting supernatant från en donator stam (potentiellt härbärge en toxisk förening (ar)) på ett stelnat mjukagar overlay som ympas med en bakterieteststam (potentiellt känsligt för den toxiska förening (ar)). Vi utnyttjade denna teknik för att screena ett bibliotek av Pseudomonas syringae stammar för intraspecific dödande. Genom att kombinera denna metod med ett utfällningssteg och riktade gen deletioner kan flera giftiga ämnen som produceras av samma stam differentieras. De två antagonistiska medel som vanligen återvinns med denna teknik är bakteriofager och bakteriociner. Dessa två medel kan differentieras med hjälp avtvå enkla ytterligare tester. Utföra en serieutspädning på en supernatant innehållande bakteriofager kommer att resultera i enskilda plack blir mindre i antal med större utspädning, medan serieutspädning av en supernatant innehållande bakteriocin resulterar en clearing zon som blir enhetligt grumligare med större utspädning. Dessutom kommer en bakteriofag producera en clearing zonen när i fläckar på ett färskt mjukagar overlay ympats med samma stam, medan en bakteriocin inte kommer att producera en clearingzonen när de överförs till ett färskt mjukagar gräsmatta, på grund av utspädning av bakteriocin.
På senare tid har det skett en betydande intresse av att fördjupa vår förståelse av mikrobiell ekologi (särskilt microbiomes olika miljöer), liksom nya antibakteriella föreningar för användning i kampen mot antibiotikaresistenta patogener 1,2. En sammanbindande tema mellan dessa intressen är att förstå antagonistiska interaktioner mellan bakteriestammar i deras naturliga miljö. Det finns många sätt på vilka bakterier antagoniserar konkurrenter 3. Bakteriociner, en mångskiftande grupp av protein, antibakteriella föreningar, har länge studerats för sin roll vid mediering interbacterial antagonism, med två av de mest studerade arterna vara Pseudomonas aeruginosa 4,5 och Escherichia coli sex viktiga humana patogener. Förutom bakteriociner, kan inducerade profager också fungera som anticompetitor medel, vilket gör att en stam att invadera in i en nisch som redan är koloniserat 7. Pseudo syringae är en växtpatogen kända för att producera en matris med antimikrobiella medel, inklusive enkla protein bakteriociner 8, bakteriofag tail härledda bakteriociner 9 (benämnda tailocins), såväl som icke-proteinartade sekundära metaboliter 10. Nyligen har det funnits intresse för att förstå hur dessa antimikrobiella medel påverkar ekologi denna organism, samt hur de kan utnyttjas för att styra växtsjukdomar 11.
En allmänt används metod för att studera både bakteriociner och bakteriofager är den mjuka agar teknik. Denna metod beskrevs först av Gratia 1936 till stöd räkna bakteriofager 12,13.
Här beskriver vi tillämpningen av den mjuka-agar overlay-metoden, i kombination med riktad genetisk manipulation och polyetylenglykol (PEG) utfällning, att skilja mellan tre olika antimikrobiella medel (en bakteriofag, en högmolekylär bacteriocin, och en låg molekylvikt bakteriocin) producerat av en enda bakteriestam. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det är relativt enkelt och billigt, och det är därför, trots att det är avgjort "low-tech", det är fortfarande används i stor utsträckning.
Mjuk-agar teknik som beskrivs här har i stor utsträckning under många årtionden av forskare som är intresserade av bakteriofager eller bakteriociner. De främsta fördelarna med denna metod är att det är enkelt, billigt och relativt lätt att tolka. Genom att kombinera den mjuka agar med PEG-fällning och serieutspädning kan antimikrobiella medel delas upp i höga kontra lågmolekylära medel, och replikativa kontra icke-replika medel (dvs. bakteriofag vs tailocin, respektive). Slutligen, inkorporering av riktad genetisk manipulation (radering och komplettering) av förmodade bakteriocin eller profag loci kan förankra identiteten hos en given antagonistisk förening. Vi har nyligen använt denna metod för att beskriva en ny bakteriofag härrörande bakteriocin vanligare bland Pseudomonas syringae stammar 9.
Tillväxt media och villkor som anges i detta protokoll fungerar bra för Pseudomonas syringae och sannolikt skulle räcka för andra gramnegativa bakterier som växer kraftigt under dessa betingelser. Dock kommer forskare som använder den här metoden vill optimera tidpunkten, odlingsmedium, induktion metod, och inkubationstemperaturen för deras system. De kritiska parametrar inkluderar förmå producerande kulturen samtidigt i den logaritmiska tillväxtfasen, liksom sådd mjuk-agar med tillräcklig logaritmisk fas kultur för att säkerställa en enhetlig bakteriell fördelning, men inte överdriven kultur, som kommer att skymma eventuella clearingzonerna. Det finns många bakteriociner som inte induceras som en del av SOS svar, utan snarare induceras genom peptidbaserade quorum sensing system (i synnerhet grampositiva bakteriociner 15), på så sätt, kan en forskare vill att screena flera olika induktions metoder (såsom modifiera näringsinnehållet i inducerande medium, eller gör det möjligt för utökad inkubation av producerande stam).
vid användning avdenna teknik, måste den mjuka agar overlay noggrant smält och hölls vid 55-60 ° C före tillsatsen av sådd-stammen. Vi har haft flera experiment där den mjuka agar inte grundligt smälta (även visuellt det verkade vara) och resulterade i ett överlägg med en kornig utseende. Resultat från en kornig overlay kan fortfarande vara allmänt tolkningsbar, dock är detta beroende av styrkan av hämningen (svagare hämning kommer att bli svårare att observera). En slutlig, confounding variabel att beakta när man med den här tekniken är att temperaturen hos den smälta ägarn får tillräcklig tid för att svalna före inokulering med sådd-stammen, för att undvika att döda den seeding stam. För att undvika detta problem, vi säkerställa mjuk agar är varm, men inte het, att röra. Längs dessa linjer, har vi också observerat att om vi ger otillräcklig tid för en sådd kultur anpassa sig till den smälta agar, före upphällningen overlay, återhämta vi i allmänhet dålig bakterie gTILLVÄXT, vilket gör tolkningen av specifik inhibering svåra eller omöjliga att tolka. Detta är anledningen till att vi möjliggöra ytterligare 10-15 sekunder inkubation mellan vortexa och hälla overlay. Avvägningen mellan att upprätthålla agar i en helt smält tillstånd (varmare är bättre) men inte dödlig för sådd stam (varmare är inte bättre) är en som sannolikt kommer att behöva bestämmas av en forskare genom trial and error.
Om en PEG-utfällningssteg används, skulle det vara fördelaktigt att inkludera en negativ kontroll där en steril buljongmedium bearbetas identiskt med kultursupernatanten. Detta kommer att säkerställa att döda aktiviteten är inte resultatet av kvarvarande PEG eller kloroform i provvätskan.
Eftersom både bakteriofager och bakteriociner tenderar att vara mycket specifika, är det inte ovanligt att stöta på någon uppenbar dödande aktivitet med en given kombination av stammar. Detta kan bero på en mängd olika stamspecifika reresistansen mekanismer, en är att teststammen antingen saknar eller har en okänd version av receptorn som krävs för inriktning av en viss bakteriocin eller bakteriofag.
En alternativ metod, har bakteriocin screeningsmetod beskrivits av Kawai et al. , Men lider av nackdelar och har inte fått stor spridning 16. Specifikt kräver denna teknik att observera buljongprover vid tidsintervall som kan vara betungande, och inte tillåter diskriminering mellan bakteriofag-härledda och bakteriocin härrörande dödande aktiviteter.
De huvudsakliga begränsningar av denna teknik är att den inte är väl lämpad för organismer som inte växer kraftigt (och därmed kommer att sakna lätt urskiljbara clearingzoner) eller att hamnprofager eller bakteriociner som inte är kraftigt produceras under laboratorieförhållanden. Anpassning av denna teknik för att upptäcka bakteriociner som produceras i miljöprover skulle både expandera verktygetav denna teknik och underlätta större insikt i rollen av bakteriociner inom naturliga inställningar.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |