En Muse ortotopisk Blære Tumor Model og Tumor Detection System
Summary
Denne protokol beskriver frembringelsen af murine ortotopisk blæretumorer i C57BL / 6J-mus og overvågning af tumorvækst.
Abstract
Denne protokol beskriver genereringen af blæretumorer i C57BL / 6J mus under anvendelse af murine blærekræft cellelinje MB49, der er blevet modificeret til at udskille human prostataspecifikt antigen (PSA), og proceduren til bekræftelse af tumorimplantation. Kort fortalt er musene bedøvet ved anvendelse injicerbare lægemidler og er lavet til at lægge i rygleje. Urin er forladt fra blæren og 50 pi af poly-L-lysin (PLL) langsomt indpodet med en hastighed på 10 gl / 20 s under anvendelse af en 24 G IV-kateter. Det overlades i blæren i 20 minutter ved tilstoppet kateteret. Kateteret fjernes, og PLL er forladt af let tryk på blæren. Dette efterfølges af inddrypning af den murine blærecancer-cellelinje (1 x 10 5 celler / 50 pi) med en hastighed på 10 pi / 20 s. Kateteret tilproppet at forhindre for tidlig evakuering. Efter 1 time musene genoplivet med en vending lægemiddel, og blæren er forladt. Den langsomme instillation sats er vigtig,da det reducerer vesico-ureteral reflux, hvilket kan forårsage tumorer at forekomme i de øvre urinveje og i nyrerne. Cellelinien skal være godt resuspenderes at reducere sammenklumpning af celler, da dette kan føre til ujævn tumorstørrelser efter implantation.
Denne teknik inducerer tumorer med høj effektivitet. Tumorvækst monitoreres ved urin PSA sekretion. PSA markør overvågning er mere pålidelig end ultralyd eller fluorescens billeddannelse til påvisning af tilstedeværelsen af tumorer i blæren. Tumorer i mus generelt nå en maksimal størrelse, der negativt påvirker sundhed af omkring 3 – 4 uger, hvis venstre ubehandlet. Ved at overvåge tumorvækst, er det muligt at differentiere mus, der blev hærdet fra dem, der blev ikke held implanteret tumorer. Med kun end-point analyse, kan sidstnævnte være fejlagtigt antages at være blevet helbredt ved terapi.
Introduction
Målet med denne fremgangsmåde er at generere murine ortotopisk blæretumorer og overvåge de implanterede tumorer så præcist som muligt, således at mus uden tumorimplantation ikke menes at være blevet hærdet ved slutpunktsanalyse. Samlet set viste metode vil reducere behovet for et stort antal mus til eksperimentel analyse og sikre større nøjagtighed ved bestemmelse terapeutiske resultater.
Udviklingen af et ortotopisk model for kræft er vigtig, da implanterer tumorceller subkutant ikke rekapitulere miljøet af den kliniske sygdom eller muliggøre udviklingen af terapeutiske strategier. Arkitekturen af blæren tillader inddrypning af blæren cancerterapier direkte ind i blæren med minimale systemiske virkninger. Således dyremodeller der rekapitule- dette miljø, såsom en orthotopisk model, er vigtigt at evaluere nye behandlingsformer. Konklusionerne fra enhver forsøgsopstilling er dependent ved begrænsningerne af modellen.
Adskillige teknikker er blevet udviklet til fremstilling af ortotopisk blæretumorer hos mus. Disse er afhængige af at beskadige glycosaminoglycan lag af blæren, så tumorceller, der skal implanteres. De anvendte teknikker omfatter elektrokirurgi, hvilket resulterer i et enkelt skader i blærevæggen, hvilket fører til tumorudvikling på samme sted i blæren 1,2. Men succesraten for tumorimplantation hjælp elektrokauterisation er operatørafhængigt mellem 10 – 90%, og det indeholder den fare, blærevæggen vil blive punkteret, hvilket fører til tumorer udvikler i bughulen. Kemisk cautery udføres ved hjælp af sølvnitrat, hvilke skader blærevæggen 3. Tilsvarende har syre blevet anvendt til at ødelægge blærevæggen 4. Trypsin er også blevet anvendt til at beskadige blæren samt 5. Disse fremgangsmåder kan resultere i udviklingen af mere end én tumor i blæren.Desuden er der fare for ødelæggelse blæren hvis kemikalierne efterlades i kontakt med blærevæggen for længe. Metoden er udviklet af Ninalga et al. anvender den positivt ladede poly-L-lysin (PLL) 6 molekyler til pels blærevæggen; dette muliggør de negativt ladede tumorceller til at klæbe til glycosaminoglycan lag af blæren. Denne metode resulterer generelt i mere end én tumor udvikler sig i blæren, men tumorimplantation er ved 80 – 100% 4,7. Teknisk set er det også den nemmeste procedure at udføre. For at sikre, at de tumorer, der udvikler er ret selv i størrelse, er det vigtigt, at tumorcellerne ikke er grupperet i store klumper før implantation.
For at evaluere terapeutisk effektivitet, er det bedst at udføre denne undersøgelse på mus med nogenlunde samme størrelse tumorer. Således er en god detektering system, der kan kvantificere tumorstørrelse hurtigt efter implantation er vigtig. Adskillige strategier har bin anvendes til at evaluere tumorer. Disse omfatter magnetisk resonans (MRI) 8-10, fluorescens 11, bioluminescens 12,13, ultralyd 14, og enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) 15,16. Mens MRI og ultralyd ikke kræver modifikationer af tumorcellerne, er der behov for følsomt udstyr og kontrastmidler til MRI. De fluorescence-, luminescence-, og ELISA-assays kræver ændring af tumorcellerne til at udtrykke markørproteiner, der kan opdages af disse metoder. For luminescens, er et substrat kræves til påvisning af luciferaseaktiviteten; der er således en ekstra skridt og øgede omkostninger. Både luminescens og fluorescens kræver specialiseret udstyr. At producere fluorescens, grønt fluorescerende protein (GFP) ringslutning, som katalyseres af molekylært oxygen, er påkrævet. Således kan GFP udtryk være variabel inden for en tumor masse afhængigt af adgang til ilt, hvilket gør dette en temmelig upålidelig markør <sup> 17. Modifikation af den murine blærecancer-cellelinie MB49 til at udskille human prostataspecifikt antigen (PSA) 15,16 som en surrogatmarkør er en anden strategi. Disse markører giver også en alternativ måde at bekræftelse tumor tilstedeværelse ved afslutning af forsøget, hvilket gør dem et alternativ til immunhistokemi. Denne undersøgelse rapporterer PLL fremgangsmåde til ortotopisk tumorimplantation og præsenterer en sammenligning af tumor detektionssystemer, nemlig ELISA, fluorescens, og ultralydsbilleddannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trin i protokollen er 1) med held opretholde tumorigeniciteten af cellelinien; 2) at sikre målelig PSA sekretion før tumorcelleimplantation i mus; 3) generering af et enkelt-cellesuspension til implantation for at reducere variationen i tumorstørrelse; og 4) bibringe celler ved en langsom hastighed for at forhindre vesico-ureteral reflux, hvilket resulterer i tumorcelleimplantation i nyren.
Efter forlænget passage in vitro, kan MB49 / MB49-PSA celler miste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O’Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette–Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O’Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
