एक murine Orthotopic मूत्राशय ट्यूमर मॉडल और ट्यूमर का पता लगाने प्रणाली
Summary
इस प्रोटोकॉल महिला C57BL / 6J चूहों और ट्यूमर के विकास की निगरानी में murine ओर्थोटोपिक मूत्राशय ट्यूमर की पीढ़ी का वर्णन है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल murine मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइन MB49 है, जो मानव प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) स्रावित करने के लिए संशोधित किया गया है का उपयोग कर मादा चूहों C57BL / 6J में मूत्राशय ट्यूमर की पीढ़ी का वर्णन है, और ट्यूमर आरोपण की पुष्टि के लिए प्रक्रिया। संक्षेप में, चूहों इंजेक्शन दवाओं का उपयोग anesthetized हैं और पृष्ठीय स्थिति में रखना करने के लिए बना रहे हैं। मूत्र मूत्राशय से खाली है और पाली एल लाइसिन (पीएलएल) के 50 μL धीरे धीरे एक 24 जी चतुर्थ कैथेटर का उपयोग कर 10 μL / 20 एस की दर से डाले है। यह कैथेटर stoppering से 20 मिनट के लिए मूत्राशय में छोड़ दिया है। कैथेटर हटा दिया जाता है और पीएलएल मूत्राशय पर कोमल दबाव द्वारा खाली है। इस murine मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइन 10 μL / 20 एस की दर से (1 x 10 5 कोशिकाओं / 50 μL) की टपकाना द्वारा पीछा किया जाता है। कैथेटर समय से पहले निकासी को रोकने के लिए stoppered है। 1 घंटे बाद, चूहों एक उलट दवा के साथ पुनर्जीवित कर रहे हैं, और मूत्राशय खाली है। धीमी गति से टपकाना दर महत्वपूर्ण है,यह vesico-ureteral भाटा, जो ट्यूमर के ऊपरी मूत्र पथ में और गुर्दे में घटित करने के लिए पैदा कर सकता है कम कर देता है। सेल लाइन ठीक है, कोशिकाओं की clumping को कम करने के रूप में इस आरोपण के बाद असमान ट्यूमर के आकार को जन्म दे सकता है फिर से निलंबित किया जाना चाहिए।
इस तकनीक में उच्च दक्षता के साथ ट्यूमर लाती है। ट्यूमर के विकास को मूत्र पीएसए स्राव द्वारा नजर रखी है। पीएसए मार्कर निगरानी अल्ट्रासाउंड या मूत्राशय में ट्यूमर की मौजूदगी का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग की तुलना में अधिक विश्वसनीय है। अगर अनुपचारित छोड़ दिया 4 सप्ताह – चूहों में ट्यूमर आम तौर पर लगभग 3 से अधिकतम आकार कि नकारात्मक प्रभावों स्वास्थ्य पहुँचने। ट्यूमर के विकास की निगरानी करके, यह चूहों कि उन है कि सफलतापूर्वक ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित नहीं किया गया से ठीक हो रहे थे अंतर करने के लिए संभव है। केवल अंत बिंदु विश्लेषण के साथ, बाद गलती से चिकित्सा द्वारा इलाज किया गया है करने के लिए माना जा सकता है।
Introduction
इस पद्धति का लक्ष्य murine ओर्थोटोपिक मूत्राशय ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए और, प्रत्यारोपित ट्यूमर की निगरानी के लिए सही रूप में संभव के रूप में तो ट्यूमर आरोपण के बिना है कि चूहों अंत बिंदु विश्लेषण पर ठीक किया गया है सोचा नहीं कर रहे हैं। कुल मिलाकर, विधि प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए चूहों की बड़ी संख्या के लिए जरूरत को कम करने और चिकित्सीय परिणामों को निर्धारित करने में अधिक से अधिक सटीकता सुनिश्चित करेगा दिखाया गया है।
दाखिल ट्यूमर कोशिकाओं subcutaneously नैदानिक रोग का माहौल पुनरावृत्ति नहीं करता है या चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सक्षम कैंसर के लिए एक orthotopic मॉडल के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। मूत्राशय की वास्तुकला सीधे न्यूनतम प्रणालीगत प्रभाव के साथ मूत्राशय में मूत्राशय कैंसर के उपचार के टपकाना परमिट। इस प्रकार, पशु मॉडल, इस तरह के एक मॉडल के रूप में ओर्थोटोपिक कि इस माहौल पुनरावृत्ति, नए उपचारों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। निष्कर्ष किसी भी प्रयोगात्मक सेट-अप से तैयार कर रहे हैं dependenमॉडल की सीमाओं पर टी।
कई तकनीकों चूहों में orthotopic मूत्राशय ट्यूमर के उत्पादन के लिए विकसित किया गया है। ये मूत्राशय की ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन परत को नुकसान पहुँचाए, ट्यूमर कोशिकाओं को सक्रिय करने के प्रत्यारोपित किया जा करने के लिए पर भरोसा करते हैं। इस्तेमाल की तकनीक electrocautery, जो मूत्राशय की दीवार में नुकसान का एक बिंदु में यह परिणाम है, मूत्राशय 1,2 में एक साइट पर ट्यूमर के विकास के लिए अग्रणी शामिल हैं। हालांकि, विद्युतदहनकर्म का उपयोग कर ट्यूमर आरोपण की सफलता की दर ऑपरेटर पर निर्भर 10 से बदलती है – 90%, और यह खतरा यह है कि मूत्राशय दीवार की हवा निकाल दी जाएगी शामिल पेरिटोनियल गुहा में विकासशील ट्यूमर के लिए अग्रणी। रासायनिक दाग़ना चांदी नाइट्रेट, जो नुकसान मूत्राशय दीवार 3 का उपयोग किया जाता है। इसी तरह, एसिड मूत्राशय दीवार 4 नुकसान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Trypsin भी अच्छी तरह के रूप में 5 मूत्राशय को नुकसान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन विधियों मूत्राशय में एक से अधिक ट्यूमर के विकास में परिणाम हो सकता है।इसके अलावा, वहाँ मूत्राशय को गंभीर नुकसान का खतरा है, तो रसायन भी लंबे समय के लिए मूत्राशय दीवार के साथ संपर्क में छोड़ दिया जाता है। विधि Ninalga एट अल द्वारा विकसित की है। सकारात्मक आरोप लगाया पाली एल लाइसिन (पीएलएल) कोट मूत्राशय की दीवार को 6 अणुओं का उपयोग करता है; इस नकारात्मक आरोप लगाया ट्यूमर कोशिकाओं मूत्राशय की ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन परत करने के लिए छड़ी करने के लिए सक्षम बनाता है। इस विधि को आम तौर पर एक से अधिक ट्यूमर मूत्राशय में विकसित करने में परिणाम है, लेकिन ट्यूमर आरोपण 80 पर है – 100% 4,7। तकनीकी तौर पर, यह भी आसान प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए है। यह सुनिश्चित करें कि ट्यूमर है कि विकसित काफी भी आकार में हैं, यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूमर कोशिकाओं आरोपण से पहले बड़े गुच्छों में वर्गीकृत नहीं कर रहे हैं।
आदेश चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, यह काफी समान आकार के ट्यूमर के साथ चूहों पर यह अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छा है। इस प्रकार, एक अच्छा पता लगाने प्रणाली है कि आरोपण के बाद जल्द ही ट्यूमर के आकार यों कर सकते हैं महत्वपूर्ण है। कई रणनीतियों मधुमक्खी हैn ट्यूमर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया। ये चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 8-10, प्रतिदीप्ति 11, 12,13 bioluminescence, अल्ट्रासाउंड 14, और एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) 15,16 शामिल हैं। एमआरआई और अल्ट्रासाउंड ट्यूमर कोशिकाओं के संशोधन की आवश्यकता नहीं है, एमआरआई के लिए संवेदनशील उपकरण और विपरीत एजेंटों के लिए एक की जरूरत है। , Fluorescence- luminescence-, और एलिसा आधारित assays मार्कर प्रोटीन है कि इन तरीकों से पता लगाया जा सकता है व्यक्त करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के संशोधन की आवश्यकता है। luminescence के लिए, एक सब्सट्रेट luciferase गतिविधि का पता लगाने के लिए आवश्यक है; इस प्रकार, वहाँ एक जोड़ा कदम और लागत में वृद्धि हुई है। दोनों luminescence और प्रतिदीप्ति विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति का उत्पादन करने के लिए, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) चक्रगति, जो आणविक ऑक्सीजन द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, की आवश्यकता है। इस प्रकार, GFP अभिव्यक्ति ऑक्सीजन के लिए उपयोग के आधार पर एक ट्यूमर मास के भीतर चर हो सकता है, यह एक नहीं बल्कि अविश्वसनीय मार्कर बनाने <sup> 17। Murine मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइन MB49 का संशोधन मानव प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) 15,16 छिपाना के रूप में एक किराए मार्कर एक और रणनीति है। इन मार्करों भी प्रयोग की समाप्ति पर ट्यूमर मौजूदगी की पुष्टि के लिए उन्हें immunohistochemistry के लिए एक विकल्प बनाने का एक वैकल्पिक साधन उपलब्ध कराते हैं। इस अध्ययन ओर्थोटोपिक ट्यूमर आरोपण की पीएलएल विधि की रिपोर्ट है और ट्यूमर का पता लगाने प्रणालियों, अर्थात् एलिसा, प्रतिदीप्ति, और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की तुलना प्रस्तुत करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
1) सफलतापूर्वक सेल लाइन के tumorigenicity को बनाए रखने के प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं; 2) चूहों में ट्यूमर सेल आरोपण से पहले दर्जे का पीएसए स्राव सुनिश्चित करना; 3) के रूप में तो ट्यूमर के आकार में भिन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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