쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템
Summary
이 프로토콜은 암컷 C57BL / 6J 마우스의 종양 성장을 모니터링 뮤린 동소 방광 종양의 발생을 설명한다.
Abstract
이 프로토콜은 전립선 특이 항원 (PSA)를 분비하도록 변형 된 뮤린 방광암 세포주 MB49을 사용하여 암컷 C57BL / 6J 마우스에서 방광 종양의 생성을 설명하고, 종양 주입의 확인 절차. 간단히, 마우스는 주사제를 사용하여 마취하고 지느러미 위치에 배치하게된다. 소변은 방광 비게하고 폴리 -L- 라이신 (PLL) 50 μL를 천천히 24 G IV 카테터를 사용하여 10 μL / 20 s의 속도로 주입된다. 이는 카테터 stoppering 20 분 동안 방광에 남아있다. 카테터를 제거하고, PLL은 방광에 부드러운 압력 비게된다. 이는 쥐 방광암 세포주를 10 μL / 20 s의 속도로 (1 × 105 세포 / 50 μL)의 점적 따른다. 카테터는 조기 탈출을 방지하는 마개를한다. 1 시간 후, 마우스를 반전 약물 부활되고, 블래 더는 비게된다. 느린 점적 율이 중요이 종양은 상부 요로 및 신장에서 발생 될 수 있습니다 방광 요관 역류를 줄일 수있다. 세포주 잘이 주입 후 종양 크기 불균일을 초래할 수 있기 때문에, 세포의 응집을 감소시키기 위해 재현 탁한다.
이 기술은 고효율 종양을 유도한다. 종양의 성장은 소변 PSA 분비에 의해 감시된다. PSA 마커 모니터링 방광 종양의 존재의 검출을위한 초음파 또는 형광 이미징보다 더 안정적이다. 방치하면 사주 – 마우스의 종양은 일반적으로 약 3가 최대 크기에 부정적인 영향 상태에 도달한다. 종양의 성장을 모니터링하여,이를 성공적으로 종양이 주입되지 않은 것들로부터 경화 된 생쥐를 차별화시킬 수있다. 단지 종점 분석으로, 후자는 실수 요법으로 치료 된 것으로 간주 될 수있다.
Introduction
이 방법의 목적은 쥐 정위 방광 종양을 생성하기 위해 종양 이식없이 생쥐가 종점 분석에서 경화 된 것으로 생각되지 않도록, 가능한 한 정확하게 주입 된 종양을 모니터하는 것이다. 전반적으로, 상기 방법은 분석을 위해 실험 쥐의 다수의 필요성을 감소 및 치료 학적 성과를 결정하는데 큰 정확성을 보장한다 도시.
이식 종양 세포를 피하 임상 질환의 환경 요점을 되풀이 또는 치료 전략의 개발을 가능하게하지 않기 때문에 암에 대한 동 소성 모델의 개발이 중요하다. 블래 더의 구조는 직접 최소 전신 효과 방광 방광암 치료의 점안을 허용한다. 따라서, 이러한 소성을 모델로이 환경을 요점을 되풀이 동물 모델, 새로운 치료법을 평가하는 것이 중요하다. 모든 실험 장치에서 도출 된 결론은 dependen된다모델의 제한시 t.
몇 가지 기술은 쥐에서 동소 방광 종양의 생산을 위해 개발되었다. 이는 방광의 글리코 사 미노 글리 칸 층을 손상 주입 될 종양 세포 활성화에 의존한다. 사용 된 기술은 블래 1,2- 한 부위에서 종양 발생을 선도, 방광 벽에 손상 단일 지점 결과 전기 소를 포함한다. 그러나, 전기 소를 사용하여 종양 이식 성공률 오퍼레이터 의존적 10 변하는 – 90 %, 그리고 복강 현상 종양 선도 방광벽 천공 될 것이라는 위험을 포함한다. 화학 소작은 질산은, 손상 방광 벽 (3)을 사용하여 수행된다. 유사하게, 산 방광 벽 (4)를 손상하는 데 사용되어왔다. 트립신은도 5와 블래 더를 손상하는 데 사용되어왔다. 이러한 방법은 방광에 하나 이상의 종양의 개발에 발생할 수 있습니다.화학 물질이 너무 오래 방광 벽과 접촉하여두면 또한, 방광에 심각한 손상의 우려가있다. Ninalga 등의 알이 개발 한 방법. 양전하 폴리 -L- 라이신 (PLL) 코트 방광 벽에 6 분자를 사용한다 이는 방광의 글리코 사 미노 글리 칸 층을 고집 음전기 종양 세포 수있다. 이 방법은 일반적으로 방광 현상 이상의 종양을 초래하지만, 종양 이식 80에서 인 – 100 % 4,7. 기술적으로는 수행 할 수있는 가장 쉬운 방법이기도하다. 개발 종양도 상당히 크기되도록, 상기 종양 세포를 이식하기 전에 큰 덩어리로 분류되지 않는 것이 중요하다.
치료 효능을 평가하기 위해, 상당히 유사한 크기의 종양을 가진 마우스에서 본 연구를 수행하는 것이 최상이다. 따라서, 주입 직후 종양 크기를 정량화 할 수있는 좋은 검출 시스템이 중요하다. 몇 가지 전략은 꿀벌이여기서 n은 종양을 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 자기 공명 영상 (MRI) 8-10 형광 11, 12, 13, 생물 발광, 초음파 (14)과 효소 면역 분석법 (ELISA) (15, 16)을 포함한다. MRI와 초음파 종양 세포의 수정이 필요하지 않지만, MRI 민감한 장비 및 대조 제제에 대한 필요성이 존재한다. luminescence-, fluorescence- 및 ELISA 기반 분석은 다음 방법에 의해 검출 될 수있는 마커 단백질을 발현하는 종양 세포의 수정을 요구한다. 발광 들어, 기판은 루시퍼 라제 활성의 검출을 위해 필요하다; 따라서, 추가 단계와 비용 증가가있다. 모두 발광 및 형광 전문 장비가 필요합니다. 형광을 생성하기 위해 산소 분자에 의해 촉매되는 녹색 형광 단백질 (GFP) 고리가 필요하다. 따라서, GFP 발현이 다소 불안정하게 마커 산소 액세스에 따라 종양 덩어리 내에 가변적 <sup> 17. 대리 마커 다른 전략으로 뮤린 방광암 세포주 MB49의 변형은 전립선 특이 항원 (PSA) (15, 16)를 분비한다. 이러한 마커 또한, 실험 종료시 종양의 존재를 확인하고 그들에게 면역 대안을 만드는 다른 수단을 제공한다. 본 연구는 동소 이식 종양의 PLL 방법을보고하고 종양 검출 시스템, 즉 ELISA 형광 및 초음파 영상의 비교를 나타낸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 1) 성공적 세포주의 발암를 유지하는 단계; 2) 마우스에서 종양 세포의 주입 전에 측정 PSA 분비를 보장; 종양 크기의 변화를 감소 시키도록 3) 주입 한 세포 현탁액을 생성하는 단계; 4) 신장 종양 세포 주입의 결과 방광 요관 역류를 방지하기 위해 느린 속도로 세포를 주입.
체외에서 장시간 통과 한 후, MB49 / MB49-PSA 세포는 쥐에서 종양?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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