Detta protokoll beskriver generering av murina orthotopic tumörer i urinblåsan i C57BL / 6J möss och övervakning av tumörtillväxt.
Detta protokoll beskriver generering av tumörer i urinblåsan i C57BL / 6J möss med användning av murina blåscancer cellinje MB49, som har modifierats för att utsöndra human prostataspecifikt antigen (PSA), och förfarandet för bekräftelse av tumörimplantation. I korthet, möss bedövades med användning av injicerbara läkemedel och är gjorda för att lägga i den dorsala läget. Urin utryms från urinblåsan och 50 mikroliter av poly-L-lysin (PLL) långsamt instilleras med en hastighet av 10 mikroliter / 20 s med användning av en 24 G IV kateter. Det är kvar i blåsan under 20 min genom att stoppering katetern. Katetern avlägsnas och PLL är tomt med lätt tryck på blåsan. Detta följs av instillation av den murina blåscancer-cellinjen (1 x 10 5 celler / 50 | il) vid en hastighet av 10 | il / 20 s. Katetern är tillsluten för att förhindra för tidig evakuering. Efter 1 h mössen återupplivas med en återföring drog, och urinblåsan är utrymd. Den långsamma instillahastigheten är viktig,eftersom det minskar Vesico-uretär reflux, vilket kan orsaka tumörer att förekomma i de övre urinvägarna och i njurarna. Cellinjen bör vara väl återsuspenderas för att minska hopklumpning av celler, eftersom detta kan leda till ojämna tumörstorlekar efter implantation.
Denna teknik inducerar tumörer med hög effektivitet. Tumörtillväxten övervakas genom urin PSA utsöndring. PSA markör övervakning är mer tillförlitliga än ultraljud eller fluorescens avbildning för detektion av närvaron av tumörer i urinblåsan. Tumörer i möss når i allmänhet en maximal storlek som negativt påverkar hälsan med ca 3-4 veckor om de lämnas obehandlade. Genom att övervaka tumörtillväxt, är det möjligt att differentiera möss som botades från dem som inte var framgångsrikt implanteras med tumörer. Med bara slutpunkten analys kan den senare felaktigt antas ha blivit botade genom terapi.
Målet med denna metod är att generera murina orthotopic tumörer i urinblåsan och för att övervaka de implanterade tumörerna så exakt som möjligt, så att möss utan tumör implantation inte tros ha blivit botade vid slutpunkten analys. Övergripande, den metod som visas kommer att minska behovet av ett stort antal möss för experimentell analys och säkerställer större noggrannhet vid bestämning av terapeutiska resultat.
Utvecklingen av en orthotopic modell för cancer är viktigt, eftersom implanterar tumörceller subkutant inte rekapitulera miljön i klinisk sjukdom eller möjliggöra utveckling av terapeutiska strategier. Arkitekturen av blåsan tillåter instillation av blåscancerterapier direkt in i urinblåsan med minimala systemiska effekter. Således, djurmodeller som rekapitulera denna miljö, såsom en orthotopic modell är viktigt att utvärdera nya terapier. Slutsatserna från en försöksuppställningen är dependent på de begränsningar av modellen.
Flera tekniker har utvecklats för produktion av orthotopic blåstumörer i möss. Dessa är beroende av att skada glykosaminoglykan skiktet i urinblåsan, vilket möjliggör tumörceller som skall implanteras. De tekniker som används inkluderar diatermi, vilket resulterar i en enda punkt av skada i blåsväggen, vilket leder till tumörutveckling vid en plats i blåsan 1,2. Dock är andelen framgångsrika tumörimplantation använder diatermi operatörsberoende varierar från 10 till 90%, och det innefattar risken att blåsväggen kommer att punkteras, vilket leder till tumörer utvecklas i bukhålan. Kemisk diatermi utförs med hjälp av silvernitrat, som skadar blåsväggen 3. På liknande sätt har syra använts för att skada blåsväggen 4. Trypsin har också använts för att skada urinblåsan samt 5. Dessa metoder kan resultera i utvecklingen av mer än en tumör i urinblåsan.Dessutom finns det en risk för allvarliga skador på urinblåsan, om kemikalierna är kvar i kontakt med blåsväggen för länge. Den metod som utvecklats av Ninalga et al. använder den positivt laddade poly-L-lysin (PLL) 6 molekyler till belägga blåsväggen; detta möjliggör de negativt laddade tumörcellerna att hålla sig till glykosaminoglykanen skiktet av blåsan. Denna metod resulterar i allmänhet i mer än en tumör utvecklas i urinblåsan, men tumörimplantation är 80-100% 4,7. Tekniskt sett är det också det enklaste förfarandet att utföra. För att säkerställa att de tumörer som utvecklar är ganska jämn i storlek, är det viktigt att tumörcellerna inte är grupperade i stora klumpar innan implantation.
För att utvärdera den terapeutiska effektiviteten, är det bäst att utföra denna studie på möss med ganska liknande storlek tumörer. Således är det viktigt ett bra detekteringssystem som kan kvantifiera tumörstorlek snart efter implantation. Flera strategier har been används för att utvärdera tumörer. Dessa inkluderar magnetisk resonanstomografi (MRI) 8-10, fluorescens 11, bioluminescens 12,13, ultraljud 14, och enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) 15,16. Medan MRI och ultraljud inte kräver ändringar av tumörcellerna, det finns ett behov av känslig utrustning och kontrastmedel för MRI. De fluorescence-, luminescence-, och ELISA-baserade analyser kräver modifiering av tumörcellerna för att uttrycka markörproteiner som kan detekteras med dessa metoder. För luminescens, är ett substrat som krävs för detektion av luciferas-aktivitet; således finns det en extra steg och ökad kostnad. Både luminiscens och fluorescens kräver specialutrustning. För att producera fluorescens, grönt fluorescerande protein (GFP) cyklisering, som katalyseras av molekylärt syre, som krävs. Sålunda kan GFP uttryck variera inom en tumörmassa beroende på tillgång till syre, vilket gör detta en ganska opålitlig markör <sup> 17. Modifiering av den murina blåscancer-cellinjen MB49 att utsöndra humant prostataspecifikt antigen (PSA) 15,16 som en surrogatmarkör är en annan strategi. Dessa markörer ger också ett alternativt sätt att bekräfta tumör närvaro vid slutet av försöket, vilket gör dem ett alternativ till immunohistokemi. Denna studie rapporterar PLL metod för orthotopic tumör implantation och presenterar en jämförelse av tumördetektionssystem, nämligen ELISA, fluorescens och ultraljudsundersökningar.
De mest kritiska stegen i protokollet är en) framgångsrikt upprätthålla tumorigeniciteten av cellinje; 2) garanterar att mätbara PSA sekre före tumörcell implantering i möss; 3) alstra en enkelcellsuspension för implantering för att reducera variationen i tumörstorlek; och 4) att ingjuta celler i långsam takt för att förhindra Vesico-uretär reflux, vilket resulterar i tumörcell implantation i njuren.
Efter långvarig passage in vitro, kan MB49 / MB49-PSA-celler förl…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
L-glutamine | Biowest | X0550 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Equipment and Software | |||
7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |