Denne protokollen beskriver dannelse av murine ortotopiske blæretumorer i hunn C57BL / 6J mus og overvåking av tumorvekst.
Denne protokollen beskriver dannelse av blæretumorer i hunn C57BL / 6J-mus ved bruk av murine blærecancercellelinje MB49, som har blitt modifisert til å utskille human prostata spesifikt antigen (PSA), og fremgangsmåten for bekreftelse av tumorimplantering. Kort fortalt blir musene bedøvet bruker injiserbare legemidler og er laget for å ligge i ryggposisjon. Urin forlates fra blæren og 50 ul av poly-L-lysin (PLL) blir langsomt tildryppet med en hastighet på 10 ul / 20 s ved anvendelse av en 24 G IV-kateter. Det er igjen i blæren i 20 min ved å legge stopper kateteret. Kateteret fjernes og PLL er forlatt med lett press på blæren. Dette etterfølges av instillasjon av den murine blærecancercellelinje (1 x 10 5 celler / 50 ul) med en hastighet på 10 pl / 20 s. Kateteret er tettet for å hindre for tidlig evakuering. Etter 1 time blir musene gjenopplivet med en reversering narkotika, og blæren er forlatt. Den langsomme instillasjon hastighet er viktig,da det reduserer vesico-urinleder tilbakeløp, noe som kan føre til svulster å forekomme i den øvre urinveiene og i nyrene. Den cellelinje bør være godt resuspenderes å redusere klumping av celler, da dette kan føre til ujevnheter i tumorstørrelser etter implantasjon.
Denne teknikken induserer tumorer med høy effektivitet. Tumorvekst blir overvåket ved urin PSA sekresjon. PSA markør overvåkning er mer pålitelig enn ultralyd eller fluorescens avbildning for påvisning av nærvær av tumorer i blæren. Svulster i mus generelt nå en maksimal størrelse som negativt påvirker helsen ved ca 3-4 uker hvis venstre ubehandlet. Ved å overvåke tumorvekst, er det mulig å differensiere mus som ble herdet fra de som ikke var fått implantert med tumor. Med bare ende-punkt-analyse, kan den sistnevnte være feilaktig antas å ha blitt herdet ved terapi.
Målet med denne metoden er å generere murine ortotopiske blæren svulster og for å overvåke de implanterte svulster så nøyaktig som mulig, slik at mus uten svulst implantasjon ikke er antatt å ha blitt kurert ved utgangen av punkt-analyse. Totalt sett, idet fremgangsmåten er vist vil redusere behovet for et stort antall mus for eksperimentell analyse og sikre større nøyaktighet ved bestemmelse terapeutiske resultater.
Utviklingen av en ortotopisk modell for kreft er viktig, da implantere tumorceller subkutant ikke rekapitulere miljøet av klinisk sykdom eller muliggjøre utvikling av terapeutiske strategier. Arkitekturen av blæren tillater instillasjon av blære kreft terapi direkte inn i blæren med minimale systemiske effekter. Således dyremodeller som rekapitulere dette miljøet, slik som en ortotopisk modell, er viktig for evaluering av nye behandlingsformer. Konklusjonene fra noen eksperimentelle oppsettet er dependent på de begrensninger i modellen.
Flere teknikker er blitt utviklet for fremstilling av ortotopiske blæren svulster i mus. Disse er avhengige av å skade glykosaminoglykan lag av blæren, slik at tumorceller som skal implanteres. Teknikkene som benyttes inkluderer elektrokauterisering, noe som resulterer i et enkelt punkt av skader i blæreveggen, som fører til tumorutvikling på ett sted i blæren 1,2. Men suksessen rate av svulst implantering hjelp elektrokauterisering er operatøravhengig varierende 10-90%, og det inkluderer en fare for at blæreveggen blir punktert, noe som fører til svulster utvikler seg i bukhulen. Kjemisk kirurgi utføres ved hjelp av sølvnitrat, som skader blæreveggen 3. Tilsvarende har syren blitt anvendt for å ødelegge blæreveggen 4. Trypsin har også blitt brukt for å skade blæren også 5. Disse metodene kan resultere i utvikling av mer enn en tumor i blæren.Videre er det en fare for alvorlige skader på blæren hvis kjemikaliene er igjen i kontakt med blæreveggen for lenge. Den metode som er utviklet av Ninalga et al. benytter den positivt ladede poly-L-lysin (PLL) 6 molekyler å belegge blæreveggen; Dette gjør at de negativt ladede kreftceller å holde seg til glycosaminoglycan lag av blæren. Denne fremgangsmåte resulterer generelt i mer enn en tumor utvikling i blæren, men tumorimplantering er ved 80 – 100% 4,7. Teknisk sett er det også den enkleste fremgangsmåten for å utføre. For å sikre at de tumorer som utvikler seg er ganske selv i størrelse, er det viktig at tumorcellene ikke er gruppert i store klumper før implantasjon.
For å kunne vurdere terapeutisk effekt, er det best å utføre denne studie på mus med nokså like store svulster. Dermed vil en god deteksjonssystem som kan måle tumorstørrelse kort tid etter implantering er viktig. Flere strategier har been brukes til å evaluere tumorer. Disse omfatter magnetisk resonansavbildning (MRI) 8-10, fluorescens 11, bioluminescens 12,13, ultralyd 14, og enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) 15,16. Mens MRI og ultralyd ikke krever modifiseringer av tumorceller, er det behov for følsomme utstyr og kontrastmidler for MRI. De fluorescence-, luminescence-, og ELISA-baserte analyser krever endring av kreftceller til å uttrykke markørproteiner som kan oppdages av disse metodene. For luminescens, er et substrat som er nødvendig for påvisning av luciferase-aktivitet; således er det et ekstra trinn og økte kostnader. Både luminescens og fluorescens krever spesialisert utstyr. For å produsere fluorescens, grønt fluorescerende protein (GFP) ringslutning, som katalyseres av molekylært oksygen, er nødvendig. Således kan GFP uttrykk være variabel innenfor en tumormasse, avhengig av tilgang på oksygen, noe som gjør dette til en ganske upålitelig markør <sup> 17. Endring av murine blærekreft cellelinje MB49 å skille menneskelige prostata spesifikt antigen (PSA) 15,16 som surrogatmarkør er en annen strategi. Disse markørene gir også en alternativ metode for å bekrefte tilstedeværelse tumor ved avslutningen av forsøket, noe som gjør dem et alternativ til immunhistokjemi. Denne studien rapporterer PLL metoden for orthotopic svulst implantasjon og presenterer en sammenligning av tumordeteksjonssystemer, nemlig ELISA, fluorescens og ultralydavbildning.
De mest kritiske trinnene i protokollen er 1) med hell å opprettholde tumorigenisitet av cellelinjen; 2) sikre målbare PSA sekresjon før tumorcelle implantasjon i mus; 3) å generere en enkeltcellesuspensjon for implantasjon, slik som å redusere variasjon i tumorstørrelse; og 4) instilling celler ved en langsom hastighet for å forhindre vesico-urinleder tilbakeløp, noe som resulterer i tumorcelle implantasjon i nyrene.
Etter lengre tids passasje in vitro, kan MB49 / MB49-PSA …
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
L-glutamine | Biowest | X0550 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Equipment and Software | |||
7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |