Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Summary

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Abstract

Metástase, a propagação e crescimento de células malignas em locais secundários dentro do corpo do paciente, representa> 90% da mortalidade relacionada ao câncer. Recentemente, avanços impressionantes em novas terapias têm prolongado significativamente a sobrevivência e melhor qualidade de vida para muitos pacientes com câncer. Infelizmente, a incidência de cérebro recorrências metastáticas está a aumentar rapidamente, e todas as terapias atuais são apenas paliativos. Assim, bons modelos animais experimentais são urgentemente necessárias para facilitar os estudos em profundidade da biologia da doença e avaliar novos regimes terapêuticos para a avaliação pré-clínica. No entanto, o padrão no ensaio de metástases in vivo por via de injecção na veia da cauda de células cancerosas produz predominantemente lesões metastáticas do pulmão; animais costumam sucumbir à carga tumoral pulmonar antes de qualquer crescimento significativo de metástases cerebrais. Intracardíaca injecção de células tumorais produz lesões metastáticas para locais múltiplos órgãos, incluindo o cérebro; No entanto, o variabidade do crescimento do tumor produzidos com este modelo é grande, amortecendo a sua utilidade na avaliação de eficácia terapêutica. Para gerar modelos animais fiáveis e consistentes para o estudo metástase cerebral, aqui descrevemos um procedimento para produzir metástase cerebral experimental na casa do rato (Mus musculus) através de injecção intracarotídeo de células tumorais. Esta abordagem permite que se produzem grande número de ratos metástase de sustentação do cérebro com características de crescimento e mortalidade semelhantes, facilitando assim os esforços de investigação para estudar mecanismos biológicos básicos e avaliar novos agentes terapêuticos.

Introduction

A metástase do cancro para o sistema nervoso central (SNC) é uma doença devastadora, e pode envolver o parênquima cerebral ou as leptomeninges ( "metástase cerebral" refere-se tanto neste artigo). É o tumor maligno intracraniana predominante, ultrapassando gliomas primários por> 10: 1 ^{1, 2.} O câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma são as principais três principais doenças neoplásicas que produzem alta incidência de metástases cerebrais ^{3, 4.} Nos últimos anos, avanços impressionantes em novas terapias contra o câncer ter prolongado drasticamente a sobrevivência ea melhoria da qualidade de vida de muitos pacientes com câncer. No entanto, após recorrência, a incidência de metástase cerebral está a aumentar rapidamente. Por exemplo, o trastuzumab anticorpo anti-HER2 (Herceptin) demonstrou eficácia clínica significativa em pacientes com cancro da mama HER2 +; ainda uma tendência preocupante surgiunestes doentes: até 1/3 daqueles cuja doença sistêmica extracraniana inicialmente beneficiou de tratamento trastuzumab mais tarde desenvolver metástases cerebrais ^{5, 6, 7.} Infelizmente, os pacientes com metástases cerebrais são refratários a quase todos os tratamentos atuais, geralmente experimentando uma deterioração traumática da qualidade de vida, e sua sobrevivência de um ano após o diagnóstico é apenas ~ 20% ^8. As terapias atuais para metástases cerebrais (incluindo esteróides, radioterapia craniana e ressecção cirúrgica em pacientes selecionados) são meramente paliativas, não curativa ^9. Portanto, metástase cerebral está a emergir como o próximo desafio imponente nesta era de novas terapias contra o câncer. Para enfrentar o desafio não satisfeitas pacientes enfrentam todos os dias na clínica, precisamos urgentemente para entender melhor o mecanismo subjacente de metástase cerebral e usar esse conhecimento para desenvolver novas terapias.

<pclasse = "jove_content"> colonização bem sucedida do cérebro por células de cancro metastáticas requer execução de uma série de funções mediadas pela interacção complexa de múltiplos jogadores biológicos, tais como o desvio da barreira hematoencefálica (BHE) e escapar a partir do cérebro do intrínseca mecanismos de defesa do sistema imunológico ^10, nenhum dos quais se condensa em um ex vivo ou in vitro sistema. Assim, adequada e fiel em modelos in vivo são fundamentais para estudos de metástase cerebral. Um ensaio in vivo convencional metástase introduz células cancerosas por via de injecção na veia da cauda, o que leva a maioria das células para se alojar no pulmão. Lesões metastáticas cerebrais raramente são produzidos nestes modelos animais antes da morte causada pela carga de tumor nos pulmões ^11. injecção intracerebral directa de células de cancro produz desenvolvimento de tumor consistente no SNC e é amplamente utilizada nos estudos de gliomas primárias. No entanto, such injecção compromete a certificação e provoca lesão traumática no local da injeção, ambos principais pontos de preocupação quanto à relevância fisiológica deste modelo. Outra via introdução de células de câncer freqüentemente usado, injeção intracardíaca, é fácil de administrar e não produz metástase experimental para o SNC. No entanto, as metástases simultâneas para outros do que o CNS sites de órgãos são sempre produzidos e pode causar a mortalidade de animais ^11; por conseguinte, o elevado grau de variabilidade deste modelo torna-o inadequado para a avaliação quantitativa dos mecanismos biológicos ou agentes terapêuticos, com um número limitado de animais.

Aqui nós descrevemos os procedimentos para produzir metástase cerebral experimental através da injeção de células cancerígenas na artéria carótida comum. Nós temos usado essa abordagem para dissecar as contribuições dos genes individuais para a cascata metastática de metástases cerebrais e para avaliar a eficácia da intervenção terapêuticas ^{12, 13.} As principais vantagens desta abordagem são o elevado grau de reprodutibilidade e de baixo grau de variabilidade; A maior desvantagem é a sofisticação e habilidade necessário para executar a microcirurgia.

Protocol

declaração de ética: Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Prepare células cancerosas para Injection Semear as células cancerosas um ou dois dias antes da injecção. Use meio DMEM / F12 suplementado com 10% FBS, a menos que uma forma especializada é indicada na literatura para uma linha de células particular. No dia da intervenção cirúrgica, as células da colhei…

Representative Results

Existem dois pontos em que a qualidade da injecção podem ser avaliadas. A primeira chance é pela observação do operador de mudar as cores dos vasos sanguíneos durante a injeção. Vazamento de injeções pobres pode ser facilmente observado sob o microscópio de dissecação. A colocação firme e segura do corpo do ratinho (Figura 1A) e da sua artéria carótida (Figura 1B) sobre a bola de algodão de suporte são factores críticos para injecçã…

Discussion

Os passos mais críticos para injecção arterial da carótida bem sucedida de células de cancro são: 1) anestesia profunda de rato, em preparação para a operação cirúrgica; 2) colocação constante de artéria carótida em cima do suporte de algodão; 3) a ligação apertada da artéria carótida após a injecção bem sucedida.

anestesia profunda de ~ 30 min é normalmente necessário para o desempenho cirúrgico estável sob o microscópio de dissecação. Usamos cocktail de cetami…

Materials

Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution	Sigma-Aldrich	K113
Routine Stereomicroscope Leica M50	Leica	M50	The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements.
Surgical disposable scapel	Integra Miltex	4-410	to make skin incisions
Tissue Forceps – 1×2 Teeth	Fine Science Tools	11021-12	to bluntly dissect mucles
Dumont #5 – Mirror Finish Forceps	Fine Science Tools	11252-23	to separate and prepare the carotid artery for injection
Spring Scissors	Fine Science Tools	15025-10	to cut sutures
EZ Clip Kit	Stoelting	59020	for wound cloure
BD Insulin Syringe	Becton Dickinson	328438	for cell injection
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262