הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים
Summary
Autophagy ההפעלה מועילה במניעת מספר מחלות. אחת הגישות הפיזיולוגיות לגרום autophagy in vivo הוא פעילות גופנית. כאן אנו מראים כיצד להפעיל autophagy ידי פעילות אירובית ולמדוד רמות autophagy בעכברים.
Abstract
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
Introduction
Autophagy הינו מסלול השפלה שמור באבולוציה, אשר נגרמת בתגובה לתנאי קיצון שונים כגון הרעבה היפוקסיה 1, 2. במהלך autophagy, שלפוחית כפולת הממברנה, שנקראה autophagosomes, לשלב רכיבי subcellular מיותרים או פגומים ולהעביר אותם לתוך lysosomes שפל 3. Autophagy בסל חיוני לתפקוד הסלולר ופיתוח האורגניזם, autophagy הבסיס לקוי הוא מעורב הפרעות רבות, כולל ניוון מוחיים, tumorigenesis וסוכרת מסוג 2 4, 5, 6.
Inducer autophagy הפיזיולוגי הידוע ביותר הוא רעב. עם זאת, יש לו שתי מגבלות עיקריות. ראשית, רעב לוקח תקופה ארוכה כדי לגרום autophagy ביעילות בבעלי חיים, למשל, 48 שעות של הגבלת מזון בעכבריםברוב האיברים. שנית, רעב בקושי גורם autophagy המוח, בשל אספקת חומרי מזון יציבה יחסית במוח. למעשה, זה גם קשה לזהות אינדוקצית autophagy ידי מעורר-מולקולה קטנה, כמו תרופות רבות לא יכולות לעבור את מחסום דם המוח. לכן, כדי לנתח טוב יותר את הפונקציה של הפעלת autophagy בהיווצרות מחלה, גילינו לאחרונה כי פעילות גופנית היא שיטה פיזיולוגית חזקה יותר כדי לגרום autophagy בתוך פרק הזמן קצר 7, 8, 9. בהשוואה רעבה, autophagy מושרה ביעילות על ידי הפעלת הליכון מהר ככל 30 דקות. וכך, פעילות גופנית היא גישה פיזיולוגית נוחה ורב-עצמה כדי ללמוד את המנגנון של autophagy בתיווך יתרונות בריאות ולמניעת מחלות.
ישנן מספר סמנים חלבוניים לצורך זיהוי של פעילות autophagy, כולל LC3 ו p62. LC3 (1A חלבון הקשורים microtubule / 1B-אור גהיין 3) הוא חלבון cytosolic (LC3-אני טופס) כי הוא מצומדות כדי PE (phosphatidylethanolamine) על אינדוקציה autophagy. PE-lipidated LC3 (טופס LC3-II) מגויס על ממברנות autophagosomal וניתן להשתמש בו כדי להמחיש autophagosomes כאשר שכותרתו עם GFP. טרנסלוקציה שלה מן cytosol כדי punctate מבנים של autophagosomes תחת מיקרוסקופ הוא אינדיקציה אינדוקציה autophagy. p62 הוא קולטן מטענים עבור מצעים autophagy (כגון חלבונים ubiquitination), והוא שולב autophagosomes גם כן. מאחר והחלבון נפגע lysosomes יחד עם autophagosomes, רבדיו ניתן להשתמש כדי למדוד את שטף autophagy. כאן אנו מראים כיצד להשתמש סמנים אלה לכמת autophagy ברקמות עכבר שונים המושרה על ידי פעילות גופנית אירובית, כולל פעילות גופנית כפויה (הליכון) ופעילות גופנית מרצון (ריצה גלגלים). אותו הנהלים יכולים לחול גם על in vivo מדידת autophagy לאחר הטיפול של מעוררים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Autophagy הוא תהליך קטבולי המספק אנרגיה ומפחית רעילות על ידי השפלה lysosomal של רכיבים הציטופלסמה או אברונים פגומים. לימוד autophagy חשוב להבין הסדרת הומאוסטזיס הסלולר מנגנוני תגובת לחץ. מודלים ומתודולוגיות חדשים צצים בתחום המחקר 15, כדי ללמוד כיצד autophagy לקוי תורם תה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Materials
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
