La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones
Summary
activación autofagia es beneficioso en la prevención de una serie de enfermedades. Uno de los enfoques fisiológicos para inducir la autofagia in vivo es el ejercicio físico. Aquí mostramos cómo activar la autofagia mediante el ejercicio aeróbico y medir los niveles de autofagia en ratones.
Abstract
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
Introduction
La autofagia es una vía de degradación evolutivamente conservado, que se induce en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como el hambre y la hipoxia 1, 2. Durante la autofagia, las vesículas de doble membrana, llamados autofagosomas, incorporan componentes subcelulares innecesarias o dañadas y los transportan hacia los lisosomas para la degradación 3. Autofagia basal es esencial para la función celular y el desarrollo organismo, y alteración de la autofagia basal está implicado en muchos trastornos, incluyendo neurodegeneración, la tumorigénesis y la diabetes 4, 5, 6 tipo 2.
El más conocido inductor de la autofagia fisiológica es el hambre. Sin embargo, tiene dos limitaciones importantes. En primer lugar, el hambre toma un largo período de inducir la autofagia con eficacia en animales, por ejemplo, 48 horas de restricción de alimentos en ratonesen la mayoría de órganos. En segundo lugar, el hambre apenas induce la autofagia cerebro, debido a un suministro de nutrientes relativamente estable en el cerebro. De hecho, también es difícil de detectar la inducción de la autofagia por inductores de molécula pequeña, como muchos fármacos no pueden pasar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, para analizar mejor la función de activación de la autofagia en la patogénesis de enfermedades, recientemente hemos descubierto que el ejercicio es un método fisiológico más potente para inducir la autofagia en un corto período de tiempo 7, 8, 9. En comparación con el hambre, la autofagia se induce de manera efectiva mediante la ejecución de cinta de correr tan rápido como 30 minutos. Por lo tanto, el ejercicio es un enfoque fisiológico conveniente y potente para estudiar el mecanismo de la autofagia en la mediación de beneficios para la salud y la prevención de enfermedades.
Hay varios marcadores de proteínas para la detección de la actividad de la autofagia, incluyendo LC3 y p62. LC3 (proteína asociada a los microtúbulos 1A / 1B-c luzhain 3) es una proteína citosólica (LC3-I de forma) que está conjugado con PE (fosfatidiletanolamina) a la inducción de la autofagia. LC3 lipidada-PE (forma LC3-II) es reclutado en las membranas de autophagosomal y se puede utilizar para visualizar autofagosomas cuando están marcados con GFP. Su translocación desde el citosol a punctata estructuras de autofagosomas bajo microscopía es una indicación de la inducción de la autofagia. p62 es un receptor de carga para sustratos autofagia (tales como proteínas de ubiquitinación), y se incorpora en autofagosomas también. Dado que la proteína se degrada en los lisosomas, junto con autofagosomas, sus niveles se pueden utilizar para medir el flujo la autofagia. Aquí mostramos cómo utilizar estos marcadores para cuantificar la autofagia en diferentes tejidos de ratón inducidos por el ejercicio aeróbico, incluyendo ejercicio forzado (cinta) y el ejercicio voluntario (con ruedas de rodamiento). Los mismos procedimientos se pueden aplicar también a la medición in vivo de la autofagia después del tratamiento de otros inductores.
Protocol
Representative Results
Discussion
La autofagia es un proceso catabólico que proporciona energía y reduce la citotoxicidad por la degradación lisosomal de los componentes del citoplasma o orgánulos dañados. El estudio de la autofagia es importante comprender la regulación de la homeostasis celular y los mecanismos de respuesta al estrés. Nuevos modelos y metodologías están emergiendo en el campo de investigación de 15, para estudiar cómo la autofagia alterada contribuye a numerosos procesos patol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Materials
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
