이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.
치료제, 종양 반응 뿐만 아니라 종양 및 종양 혈관 개발, 높은 동적 생물 학적 프로세스 있습니다. 조직학 정적 정보 제공 되며 올바른 해석에 대 한 충분 한 자주 없습니다. Intravital 평가, 프로세스 시간, 다음 추가 하 고 종종 예기치 않은 정보를 제공 합니다. 셀 전용 마커 및 라이브 셀 추적기, 영상 장비, 개선 및 여러 이미징 챔버의 개발을 표현 하는 유전자 변형 동물의 창조와 함께 intravital 현미경 검사 법 더 잘 이해 하는 중요 한 도구가 되고있다 생물 학적 프로세스입니다. 이 종이 공간 및 시간 방식으로 치료 효과 종양 혈관 개발의 수사를 위한 실험적인 디자인을 설명합니다. 이 설정을 사용 하 여, 선박 개발, 팁 셀 및 루멘 형성, 혈액 흐름, 넘쳐 흐름, 설립된 혈관 침대, 및 혈관 파괴의 무대 시각 고 따 랐 다. 또한, 치료 효과, intratumoral 운명, 그리고 화학요법 화합물의 지역화 또한 다음 수 있습니다.
생체 외에서 연구 고해상도 키네틱 이미징 프로세스를 사용 하는 동안 생체 외에서 실험 적절 한 맥락에서 평가 사용 하지 않습니다. 예를 들어, stromal 구획 또는 약물 전달 종양 내부 배포와 종양 세포의 상호 작용은 문화 접시에 공부 될 수 없습니다. 동물 모델 따라서 인간의 생리와 병 리를 모방 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 경도 이미징 프로세스, 특히 subcellular 해상도에 도전 이다. 분자 이미징 방법, 자기 공명 영상 (MRI) 등 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)과 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 부족 해결 하지만 좋은 침투 깊이 또는 해 부 구조를 설명 하기 위해 실패. 광학 이미징 높은 해상도 제공 하 고 구조, 이미징 가능 하지만 그것은 동반 가난한 최소 침투1. 응용 프로그램 창 함께에서 intravital 현미경의 skinfold 챔버는 지 느 러 미와 같은 기술 또는 복 창, 고해상도 이미징 vivo에서2,,34에 대 한 있습니다. 이 기술은 고유한 이점이 있다, 이미징 프로세스 (예를 들어, 세포 세포 상호 작용 군데 조직에), 적절 한 맥락에서의 고 해상도의 광학 한계에 대 한 시간 및 일도, 경도 이미징에 대 한 허용 고급 confocal 및 multiphoton 현미경입니다.
유전자 변형 동물 세포 또는 단백질 특정 형광 라벨의 비보와 ex vivo 실험에 대 한 가능성의 과다를 열립니다. 대 한 인스턴스, 세포 세포 상호 작용, 단백질의 생산 및 조작 이나 치료에 응답은 공부 될 수 있다 vivo에서 이들을 사용 하 여5,6,,78모델. 중요 한 것은,에 위치 장소 및 시간 적절 한 영상 장비와 방법론 결정 될 수 있다. Intravital 현미경 검사 법, 여기는 수정에 이식 종양에 에이전트와 함께 조합에 내 피 마커를 표현 하는 동물의 등 쪽 피부 집계 창 챔버 제공 됩니다.
종양 및 종양 선박 개발 뿐만 아니라 종양 치료 효과 매우 동적 프로세스, intravital 평가 시간 및 공간-종속 방식으로 이러한 프로세스의 올바른 평가 만들기 위해 우아한 도구입니다. 라이브 셀 마커, 유전자 변형 동물의 창조 및 이미징 modalities의 발전의 증가 가용성, intravital 이미징 점점 더 인기가 되고있다. 조직학은 여전히 정기적으로 사용 하 고, 그리고 셀 및 구조를 식별 하는 다양 한 마커를 사용할 수 있습니다, 비록 조직 단면는 단점이 때 동적 프로세스를 조사 하 고 있습니다. 조직 해 부 필요한 정적 정보만을 제공 하는 고정에 영향을 미치는 조직 품질; 그리고 저 미 손상 세포 상호 작용입니다. 또한, 동적 프로세스를 조사할 때 다르고 자주 추정 시간 포인트에서 해 부 조직에는 동물의 대량을 필요 합니다. Intravital 영상과 XYZ 공간 차원과 시간의 여분의 차원을 만드는 다른 플레이어의 적절 한 위치 가능한 공간과 시간에서 동일한 동물에 평가할 수 있습니다. 따라서, 최적의 시간 포인트를 놓친 하지 고 실험 당 사용 동물 수는 크게 감소 합니다. 둘째, intravital 평가와 설립 시간 창 조직 추출을 최적화 하기 위해 추정 될 수 있습니다. 셋째, 선박 성장의 원하는 단계 intravitally 확인 하 고 전체 마운트 조직으로 스테인드 될 수 있습니다.
Intravital 디자인이이 원고에 언급 된 피부 집계 챔버 모델 및 전용된 다 confocal 현미경 등 변경된 된 내 피 세포에 형광 라벨을 표현 하는 유전자 변형 동물의 조합을 사용 합니다.
내 피 세포 신생, 중 단계21,22 의 숫자를 통해가 고 이러한 단계 종종 종양에서 동시에 볼 수 있습니다. ENOSTag-GFP 마우스 선을 사용 하 여, 개별 내 피 세포는 지켜질 수 있다, 그리고 심지어 filopodia 역학 추적 될 수 있다. 따라서 intravitally 선박 개발을 공부 하기 좋은 모델입니다. 이미 존재 하는 본질적인 라벨에 따라 형광 에이전트 루멘 형성, 혈액 흐름, 넘쳐 흐름, 그리고 혈액 클리어런스를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 마우스는 최대 5 h에 대 한 지속적으로 몇 군데. 동물의 장기 평가 가능한 동물의 마 취에 관한 몇 가지 예방 조치는 촬영 된 이전에 설명한23. 이 연구는 암에 초점을 맞춘로 종양 조직이 나 세포 이식 했다. 그러나, 우리는 또한 중반와 배아 폐 실험. 그러나, 연구 조직의 성장 속도 제한, 몇 주 후 피부 regrow, 시작으로 느린 성장 종양 또는 조직에 문제가 될 수 있는.
유효성 검사 단계 동안 피부 집계 창 챔버 상당히 수정 등 쪽에 비해 클래식 모델4. 프레임 멸 합성 물자의 건설 하 고 가볍고 작은, 큰 창 보기 영역. 고정 링 (그림 1Bg, 흰색 화살표)의 후크 링의 쉬운 제거를 위해 사용 됩니다. 리 테 이너 링 후크 없이 이러한 이미지를 방해 하는 경우 사용할 수 있습니다. 피부는 확장 되지 너무 많이 풀면이 모델에서 발생 하지 않습니다 하 고 감염만 거의 볼 수 있습니다. 이러한 수정 동물 불편을 감소 하 고 크게 동물 절차를 구체화. 또한, 금속 부품 종양 MRI24를 사용 하 여 이미징 때 쉽게 제거 될 수 있습니다.
모든 현미경 intravitally 이미지 등을 채택 수 있습니다 피부 집계로 약 실. 주요 요구 사항은 현미경 단계와 목표 렌즈 사이의 사용 가능한 공간입니다. 이미징에 영향을 미치는 중요 한 측면은 모션. 모션 아티팩트를 방지 하기 위해, (모든 삽입의 제거) 후 현미경 테이블에 맞는 마우스를 지 원하는 플랫폼을 사용 한다. 그것은 마 취, 그리고 자유롭게 마우스 숨을 수 있도록 더 나은 마우스를 묶을 필요는 없습니다. 그러나, 창 보기의 필드의 최적의 고정을 주는 플랫폼에 나올 (즉, 종양 창 챔버를 통해 표시 됩니다). 플랫폼은 동물 난방에 사용 되는 전자가 열 패드를 사용 하 여가 열. 이 플랫폼은 사내, 되었다 하 고 구체적인 요청 시 얻을 수 있습니다. 고해상도 렌즈 필요성 세포내 프로세스를 평가할 때 이며 세포질과 핵 사이 차별을 가능 하 게 합니다. 비교적 긴 하지만 좋은 광학 해상도 (높은 NA) 테이퍼 렌즈를 사용 하 여 작동 거리 (선호 2 m m 이상)는 것이 좋습니다. 영상에서 한계는 침투 깊이 라벨의 형광 강도 이다. 또한, photobleaching, phototoxicity, 및 채도 이미징 동안 피해 야 한다.
여기, 통합된 confocal 다 고 confocal 현미경 사용 되었다. 다는 직 립는 confocal는 거꾸로 현미경 이다. 똑바로 현미경의 장점은 물 침수 렌즈의 쉬운 사용입니다. 이 렌즈는 높은 없음 및 긴 작동 거리, (예를 들어, 20 또는 40 X) 높은 확대에도. 특히, 여러 회사에서 판매 되는 20 X 나 1.0 물 침수 렌즈를는 것이 좋습니다. 집중 렌즈를 사용 하면 렌즈와 침수 액체 필요가 37 ° c.에가 열 될 다는 것을 유의 최고의 이미지에 대 한 것이 좋습니다 최적의 confocal 설정을 사용 하려면 (즉, pinhole 1 공기 단위에 레이저 출력 가능, 이득 너무 높은 최저 (특히 도입 하는 경우는 이득 잡음), 최대, 및 아무 검사의 평균 속도 줄). 과다 노출, 채도 및 이미지 사이의 강도 차이 데이터 품질을 타협. 채도, 노출 과도 방지 하는 것이 좋습니다. 이 다른 이득 설정에서 이미지를 획득 하 여 피할 수 있습니다. 이득은 변경 이미지의 밝기를 변경 하는 쉬운 방법은 이다. 필요한 경우, 레이저 힘을 조정할 수 있습니다. 이미지 품질을 표준화, 슬라이드 고정된 형광 강도 사용할 수 있습니다. 하나는 현미경을 최적으로 설정 하는 경우에 이미지 품질 좋은 정도 의해 결정 됩니다 창 챔버와 조직의 품질 염두에 두어야 한다
여러 형광 마커를 동시에 검색 하는 경우 출혈-통해, 하나의 fluorophore의 또 다른 채널에 감지 피해 야 한다. 최소한의 겹치는 스펙트럼 fluorophores의 조합을 사용 하 여 도련 통해와 순차 프레임 사이의 검색 하지 마십시오. 여기에 제시 된 이미지 3 순차 스캔을 사용 하 여 스캔 했다 (트랙 1: GFP, DID 또는 488 고 633 레이저; fluor647 트랙 2: rhodamine, Doxil, 또는 543 레이저; mTomato 및 트랙 3: 405 레이저 Hoechst).
종양 혈관 개발, 팁 셀 역학, 루멘, 넘쳐 흐름, 형성과 혈관 손상의 몇몇 단계 평가의 가능성이 여기에 표시 됩니다. ENOStag GFP 라인을 사용 하 여, 종양 영역 파괴 혈관 침대와과 립된 세포 남은 여전히 GFP를 표현 하 여 쉽게 검색 됩니다. 아니 주사 에이전트 흐름의 부족을 나타내는이 지역에서 발견 되었다. 화학요법 에이전트 관리이 즉도이 지역에 도달 하지 것입니다. 그러나, 선박 파괴는 치료 결과 될 수 있습니다. 사전 평가 치료 전 혈관 파괴에 대 한 확인 하는 종양의 정확한 치료 평가 대 한 필수 이며이 실험 설계를 사용 하 여 쉽게 수행할 수 있습니다.
가능성 있는 intravital 현미경 검사 법을 사용할 수 있습니다의 과다 이며 자세한 내용은이 책의 범위를 벗어납니다. 가능한 응용 프로그램 간단한 통찰력을 주고, 종양 조직, 혈관 (예를 들어, 선박, 분 지, 및 교차로의 수)와 혈액의 흐름, 세포 세포 상호 작용의 개발에 chemotherapeutics의 축적에 대 한 연구를 포함 대상으로, 그리고 세포내 처리 뿐만 아니라 위에서 언급 한 하 고 여기에 표시 된 예제 셀. 형광에 분석을 기반으로, 강도 변동 창 또는 조직의 품질을 알고 있어야 합니다. 또한, 상대적으로 두꺼운 종양 조직으로, 형광 위에서 또는 보기의 비행기 아래 이미지에서 신호에는 영향을 있다. 객관적인 측정 양적 이미지 분석을 결합 하는 것이 최상 이다. 예를 들어, 약물 농도에 관심이 intravital 현미경 검사 법 후 창에서 종양 조직을 제거 고 약 confocal 이미지와 비교를 HPLC를 사용 하 여 콘텐츠를 확인 합니다.
이 모델을 사용 하 여 잘 하지만 몇 가지 주의와 종양 응답의 평가 수행할 수 있습니다. 하나는 종양도 성장 안쪽, 피부에 깨 달아야 한다. 3D 측정 침투 전체 종양을 충당 하기 위해 충분히 깊은 경우에 할 수 있다. 이러한 경우, 빨강 염료를 사용 해야 합니다. 창 상공으로 여기에 설명 된 종양 피부 환경에서 거래 하 고 지적 윈도우 일반 마우스 체온 보다 약간 낮은 온도 유지 하는 것이 중요 하다. 따라서, 공부 intravital 연구는 지를 확인 하는 바로 마이크로 환경 설정에서 종양 피부 집계 창 챔버 최상 이다. 중요 한 것은,는 등 피부 집계 챔버 프로세스와 치료의 개선을 위한 수단으로 제공 하는 메커니즘의 활동에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 또한, biodistribution와 약물 동력 학에 대 한 추가 정보를 얻을 수 있습니다. 고전적인, 이러한 biodistribution 연구는 종양 방위 동물을 치료 하 고 해 부 종양/장기 약물 이해를 측정 하 여 수행 됩니다. Intravital이 모델을 사용 하는 약물 (즉, 혈관 내, intratumoral, 세포내, 또는 핵)의 intratumoral 위치5,,2526제공할 수 있습니다. 뿐만 아니라 또한 시간 창-의-기회 가장 최적의 통풍 관에 대 한 하지만, 밝혀 약물의 위치가 이다.
이 문서에서 설명 하는 실험 설계를 사용 하 여 다양 한 매개 변수는 시간적, 공간적 환경에서 평가할 수 있습니다. 특히, 여기 우리가 그 intravital 현미경 종양 혈관 개발 및 치료 응답의 역학에 중요 한 통찰력을 제공 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그들의 개발 및 eNOSTag GFP 선, 주스 트 차적 Rens 동물 작품, 그의 기술 지원 및 그들의 도움에 대 한 동물 관리의 기부에 대 한 Rien 밴 Haperen와 Rini 드 크롬을 감사 하 고 싶습니다. 사용 하는 현미경 시설 에라스무스 광학 이미징 센터의 일부 이며, 우리는 그들의 서비스에 대 한 OIC의 직원을 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 “Stichting 에라스무스 Heelkundig Kankeronderzoek,”, “Vereniging Trustfonds” 에라스무스 대학교 로테르 담, 네덜란드 암 협회에서 부여 DDHK 2000-2224에 의해 지원 되었다 그리고 우리는 그들의 관대 한 기부에 대 한 위원회의 회원을 감사 합니다.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |