We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
Het toenemende gebruik van geautomatiseerde hoog gehalte analyse (HCA) in drug discovery 1 tot assay verbinding bibliotheken wordt aangevuld door de ontwikkeling van life science fundamenteel onderzoek in de richting van geautomatiseerde imaging-experimenten voor systematisch onderzoek, bijvoorbeeld voor fenotypische schermen van siRNA bibliotheken. Geautomatiseerde HCA wordt ook steeds belangrijker voor kleinere schaal biologische studies die typisch zijn met handmatige experimenten met tientallen gerechten cellen afgebeeld met conventionele microscopen hebben geïmplementeerd. De door de mogelijkheid om honderden testen en analyseren van duizenden gezichtsvelden verleende statistische power maakt middeling van experimentele noise (met inbegrip van "biologische ruis") en de automatisering van het data-acquisitie en analyse van grote steekproef arrays kunnen helpen elimineren operator vooroordelen en vaak kan worden gebruikt om het optreden van systematische fouten, zoals een verandering in de IRF profiel tijdens een overname detecteren. Fluorescentie gebaseerde testenworden op grote schaal toegepast in HCA, met de meeste commercieel verkrijgbare HCA instrumentatie die fluorescentie-intensiteit beeldvorming in één of meer spectrale kanalen om de relatieve verdeling en co-localisatie van gemerkte eiwitten in kaart. Meer geavanceerde fluorescentie beeldvormende technieken, zoals fluorescentie lifetime imaging (FLIM), polarisatie anisotropie beeldvorming en de tijd ontbonden fluorescentie anisotropie beeldvorming, zijn niet op grote schaal uitgebuit in de commerciële HCA instrumenten, hoewel ze bieden krachtige kwantitatieve uitlezing, bijvoorbeeld van eiwit interacties. Hier presenteren we een open source aanpak van de tenuitvoerlegging FLIM in een geautomatiseerd microscoop voor HCA.
Fluorescentie levenstijd wordt een inherent spectroscopische ratiometrische uitlezing die kunnen worden gebruikt om verschillende moleculaire soorten te onderscheiden of de lokale omgeving van een moleculaire sonde fluorofoor en is ongevoelig voor fluorofoor concentratie excitatie / detectie-efficiëntie en het effect van scattering en sample absorptie 2. Aangezien fluorescentie levensduur metingen kunnen worden vervaardigd van één spectraal kanaal ze rechtstreeks onderling vergelijkbare instrumenten en monsters zonder kalibratie. Ze kunnen worden toegepast op endogene fluoroforen, waaronder een aantal cellulaire metabolieten, lipiden en extracellulaire matrixcomponenten, intrinsieke uitlezingen van biologische processen en ziekten te verschaffen. Zo label-free FLIM kan in kaart metabole veranderingen in de cellen 3,4 en is toegepast om toezicht te houden stamcel differentiatie 5,6 en de groei van collageen steigers 7. We hebben onlangs aangetoond dat FLIM HCA kan worden gebruikt voor automatische labelvrije assays van cellulaire metabolisme gebruik autofluorescentie 8. Vaker echter fluorescentie levensduur metingen en FLIM toegepast op exogene fluoroforen die specifieke biomoleculen label, vaak uitgevoerd met behulp van kleurstoffen die cellulaire compartimenten vlekken, gebruik kleurstoffen gekoppeld antibodies dat specifieke eiwitten targeten gefixeerde cellen of middels genetische uitdrukking fluoroforen gekoppeld aan specifieke eiwitten. Fluorescentie levenstijd kan worden gebruikt om robuuste kwantitatieve uitlezingen van fluorescente probes waarnemen van hun fysische of chemische omgeving. Voor voorbeelden, zijn kleurstoffen ingezet om de lokale lipidefase van celmembranen 9 of mobiele viscositeit 10 en genetische uitdrukking fluorescerend eiwit gebaseerde biosensoren zin zijn ontwikkeld om de concentratie van cellen signaalmoleculen bericht ook als IP3 11, PIP2 12 en calpaïne 13 of ionen zoals calcium 14,15, kalium- 16 chloride en 17.
Veel van dergelijke biosensoren gebruik Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 tot uitlezingen van veranderingen in de conformatie biosensor te verschaffen. FRET tussen "donor" en "acceptor" fluoroforen gebeurt via een korte afstand direct dipool-dipool interactiewaarvoor fluoroforen worden typisch gescheiden door minder dan ~ 10 nm. Dus de detectie van FRET geeft de nabijheid van geschikte wijze gemerkte eiwitten en verschaft derhalve een middel te lezen eiwit-eiwit interacties 20 zoals binden of oligomerisatie – hetzij als eindpunten in gefixeerde cellen of dynamische gebeurtenissen tijdsverloop metingen van levende cellen. Door het merken van een geschikt moleculair construct met de donor en acceptor fluoroforen, is het ook mogelijk uit te lezen conformatieveranderingen – of splitsing – het construct de verandering in FRET en dit is de basis van veel 21 biosensoren. Metingen van de FRET-efficiëntie kan informatie over de donor-acceptor afstand en de bevolking fractie van donor fluoroforen ondergaan FRET bieden. Aldus kan FRET-gebaseerde beeldvormende technieken worden gebruikt in kaart brengen en kwantificeren moleculaire interacties in ruimte en tijd, bijvoorbeeld op het ophelderen cell signaling verwerkt 22. Automaating dergelijke beeldvormende technieken kunnen high throughput testen leveren gebaseerd op de uitlezing van signaalwegen of netwerken.
In HCA, de FRET uitlezing meest toegepast is spectrale ratiometrische beeldvorming, waarbij veranderingen in de verhouding van de acceptor de donor intensiteit toegewezen. Deze aanpak wordt gemakkelijk uitgevoerd – en is in vele commercieel verkrijgbare multi- plaatlezers – kwantitatief spectraal opgelost FRET metingen vereisen kalibratie van de spectrale respons van het systeem 23. Dit omvat spectrale overspraak gevolg van spectrale doorbloeding en directe excitatie van de acceptor en de transmissie van het instrument en het monster (binnen filter effect). In principe houdt dit meting van extra "control" monsters die zijn gelabeld met hetzij donor alleen of acceptor alleen-.
Uit zulke spectrale ratiometrische FRET metingen effectief FRETefficiëntie (het product van de werkelijke FRET efficiëntie en fractie van FRETing donor / acceptor moleculen) kan worden verkregen met de relatieve verhouding van donor en acceptor moleculen 24. Spectrale ratiometrische FRET wordt vaak gebruikt met unimoleculaire FRET biosensoren, waarbij de donor / acceptor stoichiometrie kan worden bekend verondersteld. Om de populatie van de fracties FRETing donor en acceptor, bijv bepalen om een dosis respons curve te verkrijgen, is kennis van de feitelijke FRET efficiëntie vereist. Dit kan worden verkregen door het meten van een positieve FRET controlemonster met bekende eigenschappen of door een andere methode om de FRET-efficiëntie te meten, zoals acceptor fotobleken of FLIM.
Via fluorescentie levensduur uitlezingen kunnen FRET worden gedetecteerd en gekwantificeerd door meting van de donor emissie alleen – waardoor de noodzaak voor spectrale kalibratie en andere controlemonsters. Zo kan FLIM FRET uitlezingen worden vergeleken tussen de instrumentenen tussen de verschillende monsters – zodat de gegevens van endoscopie of tomografie van levende ziektemodellen 25 te worden getoetst aan de metingen van cel-gebaseerde testen. Door toepassing donor fluorescentievervaltijd profielen een geschikt multi-exponentieel model overeenkomt met FRETing en niet- FRETing donor populaties, FRET-efficiëntie en bevolking fracties kunnen in principe rechtstreeks verkregen zonder verdere metingen. Deze aanzienlijke voordelen, echter ten koste van FLIM die meer gedetecteerde fotonen per pixel dan spectraal opgelost intensiteit imaging – typisch honderden fotonen moeten nauwkeurig in leven bepaling van 10% te bereiken bij bevestiging aan een exponentieel verval model wanneer fitting fluorescentievervaltijd profielen complex (multi-exponentieel) modellen, het aantal gedetecteerde fotonen nodig stijgt tot duizenden. Dit heeft gewoonlijk geleid tot lange acquisitietijden (tientallen tot honderden seconden per veld view) voor FLIM, in het bijzonder bij het gebruik van de tijd gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) uitgevoerd met een sequentiële pixel acquisitie in laser scanning microscopen. Pogingen om de beeldvormende snelheid met gebruik van hogere excitatie intensiteit kan leiden tot aanzienlijke fotobleken en / of fototoxiciteit. Samen met onvoldoende geschikte commercieel verkrijgbare instrumenten en software, is dit FLIM verhinderd in gebruikelijke HCA voor geneesmiddelen of biologische systemen, waar honderden tot duizenden gezichtsvelden worden afgebeeld. Laser scanning TCSPC FLIM is in een geautomatiseerde multiwell plaat microscoop 26 voor secundaire metingen uitgevoerd na de identificatie van "hits" van steady-state-polarisatie fluorescentie anisotropie imaging 27, die vergelijkbaar imaging snelheden kunnen bereiken tot spectrale ratiometrische beeldvorming 28 waarmee het aandelen vele voordelen en nadelen. Fluorescentie anisotropie beeldvorming exploiteert de dalingin fluorescentie anisotropie van de acceptor in aanwezigheid van FRET en is ook gevoelig voor spectrale overspraak (bijvoorbeeld directe excitatie van de acceptor). Het vereist kalibratie verantwoorden polarisatie overspraak en geeft geen directe meting van FRET efficiëntie.
Om de voordelen van FLIM voor HCA te realiseren, hebben we gewerkt om de problemen van de snelheid van het beeld overname en ruimere toegang tot de technologie aan te pakken. Hier bieden we een volledige lijst van open source software en hardware componenten die kunnen worden gebruikt om de automatische snelle FLIM multiwell plaat lezer die hieronder beschreven, samen met een exemplaar FRET gebaseerde-assays uit te voeren. In onze benadering 29 wordt FLIM gerealiseerd met behulp van groothoek-time-gated beeldvorming middels een gesloten optische beeldversterker (GOI), wordt geïllustreerd in figuur 1 die snellere beeldvorming en lagere fotobleken dan één aftasting TCSPC door het kunnen verschaffen parallel pixel INTERRogation. Onze openFLIM HCA-instrument kan zonder toezicht FLIM verschaffen, is er slechts een paar seconden om FLIM Datadetecteerwerkwijze enkele 100 fotonen per pixel (afhankelijk van de helderheid van het monster) te verkrijgen. In combinatie met de tijd die nodig is om het monster uit het vorige gezichtsveld verplaatsen, de verwerving instellingen en het monster in focus te houden, resulteert typisch in multi-putjesplaat opnametijden van ~ 10 s per gezichtsveld 25,28. Optische sectie kan worden geïmplementeerd met behulp van een quasi-wide-field Nipkow ( "spinning disc") scanner 30.
Voor FLIM data-analyse, hebben we een open source software tool genaamd FLIMfit 31 dat in staat is om snel te analyseren multi-putjesplaat FLIM datasets van conventionele pc's en is een plug-in voor OMERO 32 ontwikkeld. FLIMfit biedt wereldwijde analysemogelijkheden (besproken in paragraaf 1.2) dat FLIM gegevens in staat stellen om complexe modellen met o te worden gemonteerdlleen een paar 100 fotonen per pixel in de veronderstelling dat de fluorescentie levensduur componenten zijn invariant over een afbeelding of de regio van belang (ROI), dus het aantal gedetecteerde fotonen nodig, het licht blootstelling aan het monster en beeldacquisitie tijd verminderen. Hardlopen FLIMfit op een standaard desktop PC, vereist slechts 10s seconden van computationele tijd om datasets bestaande uit honderden EPB analyseren. Dus zowel FLIM data-acquisitie en analyse kan worden uitgevoerd op tijdschalen die handig zijn in HCA zijn.
openFLIM-HCA hardware
De uitvoering van FLIM HCA omvat zes belangrijke componenten: (i) een fluorescentiemicroscoop frame met optische autofocus; (Ii) een motor (xyz) microscooptafel; (Iii) een excitatie laserbron; (Iv) een groothoek-time-gated FLIM systeem gated optische versterker (GOI), vertragingsgenerator en camera; (V) een computer voor data-acquisitie en-analyse en (vi) een Nipkowschijf scannerunit voor het optisch deelbaar beeldvorming onscherp licht te onderdrukken. Dit kan van belang zijn bij de beeldvorming van zwakke signalen, bijvoorbeeld van FRET biosensoren in de cel plasmamembraan, die kunnen worden overspoeld door bijdragen van cytoplasmatische fluorescentie of de achtergrond van dekglaasjes of het kweekmedium. Time gated FLIM gegevens verkregen door het verlichten van het monster met de ultrakorte gepulste excitatie straling, beeldvorming van de fluorescentie-emissie aan de fotokathode van de GOI en het verwerven van een reeks CCD beelden van de fosfor van de GOI voor verschillende instellingen van tijdvertraging de optische versterker uitgang na de aankomst van de excitatiepulsen. Aangezien de tijdpoort termijn na excitatie wordt verhoogd, wordt het fluorescentiesignaal gezien afneemt en de serie-time-gated fluorescentie-intensiteit beelden opgenomen op de CCD vormen de gegevensset moeten het verval profielen van alle fluoroforen analyseren het gezichtsveld . De gating van de GOI wordt gesynchroniseerd met de excitatiepulsenen, voor de reeksen van CCD acquisities de vertraging van de tijdpoort opzichte van de excitatie pulsen ingesteld op een reeks van toenemende waarden over het gewenste bereik. Deze synchronisatie wordt bereikt met behulp van de vertraging generator die een "snelle vertraging box" (het verstrekken van vertragingen tot 20 ns in 1 ps stappen) en een "grove vertraging box" dat vertragingen voorziet van een minimum stap van 25 ps omvat.
Voor FLIM, kan excitatie worden geleverd door een ultrasnelle laser. Gemakshalve we gebruiken typisch een fiber-laser gepompt supercontinuum bron die picoseconde pulsen afstembare voorziet in het zichtbare spectrum waarvan de juiste excitatie straling kan worden geselecteerd voor elk fluorofoor met een gemotoriseerde filterwiel met verschillende banddoorlaatfilters. Gewoonlijk gebruiken we een gemiddeld vermogen van ~ 100-200 uW het monster met pulsen op 40 of 60 MHz herhalingsfrequentie. Dergelijke excitatievermogens kan ook door ultrasnelle laserbronnen gebaseerd op frequentieverdubbeling van-Modus opgesloten titanium gedoopt saffier lasers. Merk op dat een excitatie pulsduur onderstaande ~ 100 ps is voldoende voor de meeste experimenten. Een tweede gemotoriseerde filterwiel met neutrale dichtheid filters wordt gebruikt om de excitatie-intensiteit te regelen. Voor veiligheid en gemak kan de excitatie straling worden geleverd via een single mode optische vezel. De configuraties voor wide-field FLIM en optisch FLIM doorsnede zijn weergegeven in figuren 2 en 3 respectievelijk. Voor meer details over de precieze componenten gebruikt, kunt u terecht op de openFLIM-HCA wiki 33. Een kopie van de huidige stuklijst wordt gegeven in het aanvullend materiaal.
Voor groothoek FLIM, wordt de excitatie straling nodig is om het gehele gezichtsveld zo gelijkmatig mogelijk te verlichten. Hierbij sturen wij de excitatie laserbundel een holografisch "top-hat" diffuser die geroteerd met 10-50 Hz tijdgemiddelde de laser speckle, met het vlak van de diffuser wordt afgebeeld op de achterkant brandvlak van het objectief lens microscoop. De fluorescentie afbeelding van de uitgang van de microscoop wordt doorgegeven op de fotokathode van de GOI en de fosfor van het GOI (actieve gebied diagonaal 18 mm) wordt afgebeeld op de sensor van een gekoelde wetenschappelijke CCD (chip grootte 10,2 mm x 8,3 mm) camera met een paar cameralenzen verschaffen een vergroting van 0,7. Het systeem wordt bestuurd door een standaard PC die is gekoppeld aan de instrumenten via RS232 protocol. Bovendien wordt een Arduino microprocessor gebruikt om een sluiter van het excitatielicht pad gesloten behalve wanneer de CCD camera verwerft FLIM gegevens en de signaal opnemen van een fotodiode die wordt gebruikt om het gemiddelde vermogen van de spectraal gefilterde supercontinuum waarden meten excitatie bron. Voor optisch doorsnede FLIM, wordt de excitatie laserstraling gekoppeld in een single-mode polarisatie-behoud optische vezel die rechtstreeks op de Nipkow schijf scannereenheid als shown in figuur 3. De uitvoer fluorescentie afbeelding van de Nipkow scanner wordt doorgegeven op de fotokathode van de GOI en de rest van het systeem is hetzelfde als voor wide-field FLIM.
openFLIM-HCA software
De data acquisitie software is geschreven in μManager 34. Het biedt volledige HCA data acquisitie functionaliteit waaronder opties om de volgorde waarin de putjes van de plaat wordt belicht wijzigen om verloop in de tijd nemen voor elke FOV, automatisch gericht houden tijdens de metingen en de excitatie en emissie filterwielen en de dichroïsche wisselaar geautomatiseerde multicolor beeldvorming. Het is ook mogelijk om een "prescan" acquisitie van fluorescentie-intensiteit draaien om automatisch te identificeren en vermelden de posities van geschikte EPB voor een volgende aankoop FLIM volgens criteria, bijvoorbeeld op basis van intensiteit. FLIM HCA gegevens kunnen worden opgeslagen als een reeksvan TIFF-bestanden, als een reeks van OME-TIFF-bestanden (dat wil zeggen, één per FOV) of als een enkele OME-TIFF-bestand waarin alle gegevens van een plaat met meerdere putjes. Meer informatie en een gedetailleerde beschrijving van de μManager software is te vinden op de openFLIM-HCA wiki 33.
De software voor gegevensanalyse, FLIMfit 31, een open source MATLAB-client voor het beeld OMERO data management platform 32, kan FLIM gegevens vanuit een OMERO server of computer disk, zoals in figuur 4. Het is ontworpen om gegevens van TCSPC of groothoek-time-gated FLIM instrumenten analyseert en biedt een groot aantal mogelijkheden om gegevens aanpassen van openFLIM-HCA inclusief fitting verval profielen monoexponential en exponentiële en hogere complexiteit verval profielen, met inbegrip van modellen zoals verdubbelen -polarisatie fluorescentie verval profielen. Het kan ook rekening houden met een vaste en tijdsafhankelijke achtergrond signalen en kan UtiLize een afgemeten ruimte-tijd-instrument response function (IRF) of kan passen met behulp van een geïdealiseerde IRF dat de tijd verschoven op een pixel-wise basis met een bedrag bepaald op basis van de volledige experimentele IRF meting kan zijn. Een globale tijdverschil (t 0) tussen de IRF en een fluorescent monster kan worden bepaald uit een meting van een standaard fluorescentie. Ruimtelijke variatie in achtergrondsignalen en IRF kan ook rekening worden gehouden. FLIMfit is in staat om FLIM gegevens passen op een pixel-wise basis of met behulp van "global binning" of "global fitting" naar montage van FLIM data met een bescheiden (honderden) te vergemakkelijken foton nummers om complexe verval modellen.
Global binning houdt het aggregeren van alle gedetecteerde fotonen van de pixels binnen een door de gebruiker gedefinieerde ROI op elk tijdstip om voldoende foton nummers bieden passend bij complexe verval modellen in te schakelen. De ROI kan het volledige gezichtsveld (FOV) zijn, kan het handmatig worden defined door de gebruiker of kan worden bepaald met behulp beeld segmentatietools. De ROI kan ook worden gedefinieerd met behulp van maskers in FLIMfit uit andere afbeelding segmentatie software geïmporteerd. FRET toepassingen is het gebruikelijk om globale binning gebruiken te bevestigen aan een dubbele exponentieel model om de fluorescentie levenstijd overeenkomstige delen FRETing en niet- FRETing donorfluoroforen die verondersteld ruimtelijk invariant in de ROI te bepalen en vervolgens monteer een pixel-wise basis daarvan teneinde de FRETing donorpopulatie fractie elke pixel verkregen vaste component vales levensduur.
Global fitting met zich meebrengt tegelijkertijd de montage van de levensduur van componenten en pixel-wise FRETing donor bevolking fracties over de gehele FOV- of over een FLIM dataset die meerdere EPB, bijvoorbeeld kunnen bestaan uit een plaat met meerdere putjes experiment of een tijdreeks van fluorescentie levensduur beelden. Global montage kan de ruimtelijke Variati benuttenbetreffende populatie van breuken in het beeld die verloren gaat in het globale binning benadering sterker beperkingen van de component levensduur schatting geven – en daardoor betrouwbare resultaten – zij het ten koste van aanzienlijk berekening 35. FLIMfit kan snel analyseren multiwell plaat FLIM datasets met de wereldwijde montage van conventionele pc-werkplekken met, bijvoorbeeld, een multiwell-time-gated FLIM dataset, verkregen met vijf tijdpoorten voor elk van 394 FOV elk bestaande uit 672 x 512 pixels, die slechts 32 seconden en 2 GB geheugen aan te passen aan een dubbele exponentieel verval model 31. Dit is bereikt door gebruik scheidbare niet-lineaire kleinste kwadraat fitting algoritme geïmplementeerd met multithreaded parallelle algoritmen effectief upscaling van multicoreprocessors en FLIMfit code is geoptimaliseerd geheugengebruik minimaliseren schakelen. Figuur 5 toont een momentopname van de grafische gebruikersinterface van FLIMfiten meer informatie is te vinden op de webpagina opgegeven in verwijzing 36. Nadere informatie over wereldwijde montage en wereldwijde binning kan gevonden worden in referentie 31.
Het volgende protocol voor FLIM HCA met behulp van onze openFLIM-HCA instrumentatie en software kan worden aangepast voor een breed scala van cell imaging experimenten met FLIM uitlezingen. In het algemeen multi-putjesplaat FRET proeven worden ontworpen repliceren putjes van positieve en negatieve controles biologische naast de omvatten onderzocht. Hier hebben we de specifieke implementatie optisch doorsnede FLIM uitvoeren beschrijven (zie figuur 3) van Cos cellen die FRET-constructen bestaande uit de mTurquoise fluorescerend eiwit en fluorescerend eiwit Venus verbonden door een korte peptide verbinder. Hier de mTq32V, mTq17V en mTq5V FRET constructies (besproken in representatieve resultaten sectie) bieden laag, midden en hoog FRET efficiëntie samen met de niet-FRETing mTq5A construeren.Deze constructen en andere materialen die nodig zijn om dit protocol te volgen zijn opgenomen in de lijst Materials.
We hebben beschreven een geautomatiseerde multiwell plaat microscoop ontworpen voor het gebruik van HCA-time gated FLIM. Dit instrument wordt gecontroleerd met behulp van open source software geschreven in μManager met de mogelijkheid van het opslaan van de gegevens naar een OMERO server en de FLIM data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van FLIMfit 36, een open source programma geschreven in Matlab en verkrijgbaar als OMERO client 32 De μManager instrument besturingssoftware, openFLIM-HCA, is online 33 verkrijgbaar met een overzicht van de systeemcomponenten 48 tot academische onderzoekers in staat te stellen hun eigen FLIM HCA instrumenten te bouwen.
Om robuuste FLIM gegevens te verwerven, is het noodzakelijk om de Indiase overheid en CCD overname instellingen te optimaliseren en rekening te houden met variaties van t 0. Zoals beschreven in 3.8.2, moet het GOI versterkingsinstelling en CCD-camera integratietijd worden bereikt ~ 75% van de CCD dynamisch bereik. Uzing hogere GOI spanningen en meerdere CCD lijst accumulaties op elk tijdstip poortvertraging verhoogt de signaal-ruisverhouding 49 maar dit verhoogt de totale FLIM acquisitietijd (omdat er minder fluorescentiefotonen per frame wordt verkregen voordat de CCD camera verzadigde en zo het aantal lijst voorkomens te verhogen) en dus deze afweging moeten worden vastgesteld voor elk experiment. De kalibratie van de vertraging generator is afhankelijk van de laser herhalingsfrequentie en het is daarom noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de juiste kalibratie-bestand voor de herhalingsfrequentie gebruikt in de acquisitie software is geladen. De procedure voor het kalibreren van de vertraging box kan worden gevonden op de openFLIM-HCA wiki 33.
Als de cellulaire autofluorescentie is laag in vergelijking met het fluorescentiesignaal, gebruiken we het signaal van een putje met alleen kweekmedium in de tijd variërende achtergrond (TVB) verschaffen. Op de achtergrond fluorescentie van de cel kweekmedium te minimaliseren, vermijden wemedium dat fenolrood. Als de cellulaire autofluorescentie significant is, wordt de TVB kan worden gemeten met de ongelabelde cellen. In dit geval moet worden, omdat dit veronderstelt dat de autofluorescentie achtergrond is hetzelfde voor elke pixel in het beeld. Deze veronderstelling is niet geldig indien de autofluorescentie varieert aanzienlijk tussen een cel of indien de excitatiebundel of detectiegevoeligheid niet uniform over het gezichtsveld.
De overname van een IRF beeld met behulp van verstrooid excitatielicht impulsen biedt het tijdelijke IRF profiel dat is convolved met het datamodel in de fitting proces en biedt ook een kaart van de ruimtelijke variatie van de IRF over het gezichtsveld. De IRF kan worden gemeten door beeldvorming een verstrooiing monster zoals een colloïdale suspensie hoewel in ons instrument, middels verstrooid excitatielicht van de Nipkow schijf zorgt voor een zuivere meting van de IRF. Nauwkeurige bepaling van de timing of de IRF is belangrijk omdat fouten in de tijd tussen de excitatie en de tijd-gating belangrijke invloed kunnen het passingsproces, met name bij het aanbrengen van complexe exponentieel verval modellen. De IRF verkregen door verstrooid excitatielicht niet precies wat nodig is voor de montage proces, omdat het is opgenomen in de excitatiegolflengte plaats bij de golflengte fluorescentie-emissie, die de timing kunnen beïnvloeden, hoewel de ruimtelijke variatie van de IRF even hoog is aan beide golflengten. Bovendien kan de verstrooide IRF globaal worden verschoven in tijd ten opzichte van de ware IRF door een uiteenlopende optische weglengte van de verstrooiing object, zoals het geval is voor een IRF verkregen van de Nipkow schijf optisch doorsnede FLIM. Deze correctie, t 0, die de vereiste globale temporele verschuiving die moet worden toegepast op de verkregen verstrooid excitatielicht IRF, wordt berekend uit het referentie monoexponential kleurstof gegevens zoals aangegeven in Protocol stap 4.4. De volgende kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor verschillende golflengten: een 75 uM Cumarine 153 in methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik 295-442 nm; een 75 pM Cumarine 6 in ethanol (τ ~ 2,43 ns 37) kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik van 430-500 nm; en 75 uM Rhodamine B-oplossing in water (τ ~ 1,7 ns 37) kan worden gebruikt voor excitatie in het bereik 488-575 nm. Wij merken op dat hoewel in FLIMfit een andere IRF gebruiken voor elke pixel van het systeem mogelijk, meestal is het redelijk om te veronderstellen dat de ruimtelijk variërende IRF dezelfde tijdsprofiel voor elke pixel in de afbeelding, maar vormt een reeks ruimtelijk variërende tijd offsets ten opzichte van de globale t0. We beschrijven dit als het IRF shift kaart, die wordt bepaald uit het verstrooide licht IRF. Samen vormen de IRF profiel, t 0 en IRF shift kaart zijn gebruikt enzorgen dat elk pixel in de FOV is voorzien van een geschikte IRF. Belangrijk is, kunnen t 0 langzaam variëren in de tijd, dus het moet worden gemeten voordat FLIM data-acquisitie.
De gebruiker moet beslissen hoe de fluorescentievervaltijd profielen bemonsteren en moet de breedte van de tijd-poorten en hun relatieve vertraging na excitatie ingesteld. In het algemeen is het wenselijk om brede poortbreedten om het gedetecteerde signaal te maximaliseren en typisch gebruik gemaakt poortbreedten ingesteld op 4 ns FLIM cellen gelabeld met fluorescentie eiwitten. Het aantal time-poortvertragingen moet voldoende zijn om de fluorescentie verval profiel (inclusief een poort ingesteld op het signaal gemeten vlak voor de excitatiepuls) Omdat fitting model dat wordt gebruikt in de monsteranalyse zijn. De optimale waarde kan afhangen van de levensduur en de relatieve amplitudes van de verval componenten. Over het algemeen 4 poorten voldoende voor montage monoexponential vervalt terwijl 7 of meer poorten kunnenworden gebruikt voor meer complexe modellen verval.
We merken op dat FLIM kan worden geïmplementeerd met behulp van een reeks van tijd-domein of frequentiedomeinen technieken en geautomatiseerde FLIM HCA van multi-putjesplaat arrays werd voor het eerst in een (niet-snijden) geïmplementeerd wide-field microscoop met frequentiedomein levensduur uitlezing van FRET 51. De eerste geautomatiseerde optische sectie FLIM multiwell plaatlezer voor HCA het gebruik van wide-field-time-gated imaging 28 werd vervolgens gemeld. Vervolgens werd groothoek (niet snijden) frequentiedomein FLIM HCA toegepast om te screenen op posttranslationele modificaties (tyrosinefosforylering) over een genbibliotheek behulp FRET 52 en time-gated FLIM HCA is toegepast om testen van HIV-1 Gag FRET oligomerisatie 53 en sumoylation van FOXM1 54 en Raichu RhoA en Rac1 biosensoren 33. Het is ook mogelijk om TCSPC gebruiken multi-putjesplaat FLIM 26 maar tot op heden het moeilijk is gebleken t overeenkomenHij doorvoer technieken benutten van wide-field detectie. Een nieuwe benadering die deze oplossing zou kunnen het gebruik van arrays van single photon counting detectors zoals SPAD arrays 55.
We merken dat uitlezingen van FRET met fluorescerende eiwitten moeten met voorzichtigheid worden behandeld en dat de absolute waarden van parameters verkregen FLIMfit of andere FLIM analysesoftware zal afhangen van de aannames in verband met de fitting model. Wanneer bijvoorbeeld het FRET donor aanzienlijk verval tweede component, kan het gebruik van een bi-exponentieel model om de FRET FLIM gegevens aanpassen gevolg van de bijdrage van de sneller bederf component, die gewoonlijk met de FRETing bevolking verschijnen hoger dan de bedoeling was. Het is daarom wenselijk om donoren te gebruiken met een mono-exponentiële levensduur zoals mTq2FP. Zelfs dan, recente studies hebben aangetoond dat FRET analyse nog kunnen worden beïnvloed door duistere toestanden van acceptor fluorescentie eiwitten of doorheterogeniteit van de oriëntatiefactor κ 2 door een verdeling van fluorofoor conformaties met verschillende chromofoor hoeken en afstanden 56. Toch hebben wij en anderen aangetoond dat fluorescentielevensduur uitlezingen van FRET produceren wel nuttige resultaten die correleren met biochemische metingen en kan worden gebruikt om te screenen op eiwit interacties of dynamiek van biosensoren volgen. Waardoor deze openFLIM HCA platform kan worden toegepast op een breed scala van fluorescentie-levensduur gebaseerde testen met gebruikmaking FRET of cellulaire autofluorescentie 8, alsmede het verschaffen van kwantitatieve uitlezing van op kleurstof gebaseerde probes 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |