Vi presenterer en åpen kildekode høy innholdsanalyse (HCA) instrument utnytte automatiserte fluorescens levetid imaging (FLIM) for analyse av protein interaksjoner bruker Förster resonans energi overføring (FRET) basert avlesninger. Datainnsamlingen for denne openFLIM-HCA instrument styres av programvare skrevet i μManager og dataanalyse er gjennomført i FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
Den økende bruken av automatiserte høy innholdsanalyse (HCA) i stoffet funnet en til analyse sammensatte bibliotekene er supplert med utviklingen i life science grunnforskning mot automatiserte bildebehandling eksperimenter for systematiske studier, for eksempel, for fenotypiske skjermer av siRNA biblioteker. Automatisert HCA blir også stadig viktigere for mindre skala biologiske studier som vanligvis har vært gjennomført med manuelle eksperimenter med titalls retter av celler bilde av med konvensjonell mikroskop. Den statistiske styrken gitt av evnen til å analysere og analysere hundrevis til tusenvis av synsfelt gjør gjennomsnittsberegning av eksperimentell støy (inkludert "biologisk støy") og automatisering av bilde datainnsamling og analyse av store prøve arrays kan bidra til å eliminere operatør skjevhet og ofte kan anvendes for å påvise forekomsten av systematiske feil, for eksempel en endring i IRF profil under et anskaffelse. Fluorescens baserte analyserer mye implementert i HCA, med de fleste kommersielt tilgjengelige HCA instrumentering med fluorescensintensiteten avbildning i en eller flere spektrale kanaler for å kartlegge den relative fordelingen og ko-lokalisering av merkede proteiner. Mer avanserte fluorescens bildediagnostikk, som fluorescens levetid imaging (FLIM), polarisering anisotropi bildebehandling og tids løst fluorescens anisotropi bildebehandling, er ikke allment utnyttes i kommersiell HCA instrumenter, selv om de tilbyr kraftige kvantitative avlesninger, f.eks protein interaksjoner. Her presenterer vi en åpen kildekode tilnærming til implementering FLIM i en automatisert mikroskop for HCA.
Fluorescens levetid gir en iboende ratiometrisk utlesning spektroskopisk som kan brukes for å skille forskjellige molekylarter, eller for å undersøke den lokale molekylære miljø av en fluorofor, og er ufølsom for fluoroforen konsentrasjon, til eksitasjon / gjenkjenning effektivitet, og til virkningen av Scattering og prøve absorpsjon to. Videre, siden fluorescens-levetiden målinger kan gjøres i en enkelt spektral kanal, de er direkte sammenlignbare mellom forskjellige instrumenter og prøver uten kalibrering. De kan brukes til endogene fluoroforer, inkludert noen cellulære metabolitter, lipider og ekstracellulære matriks-komponenter, for å gi avlesninger indre av biologiske prosesser og patologier. Dermed label-free FLIM kan kartlegge metabolske forandringer i cellene 3,4 og har blitt brukt til å overvåke stamcelledifferensiering 5,6 og veksten av kollagen stillaser 7. Vi har nylig vist at FLIM HCA kan brukes til automatisert label-free analyser av cellenes stoffskifte utnytte autofluorescence 8. Mer vanlig blir imidlertid fluorescens levetid målinger og FLIM blir påtrykt eksogene fluoroforer som merke spesifikke biomolekyler, ofte iverksatt ved hjelp av fargestoffer som flekker cellulære avdelinger, ved hjelp av fargestoffer koplet til antilegemers som er rettet mot spesifikke proteiner i faste celler, eller ved hjelp av genetisk uttrykt fluorophores koblet til spesifikke proteiner. Fluorescens levetid kan brukes til å gi robuste kvantitative avlesninger av fluorescerende prober som avføler fysiske eller kjemiske miljø. For eksempler, er fargestoffer er utplassert for å avføle den lokale lipidfasen av cellemembraner 9 eller celle viskositet 10 og genetisk uttrykt fluorescerende protein-baserte biosensorer er blitt utviklet for å rapportere konsentrasjoner av cellesignaliseringsmolekyler inkludert som IP3 11, PIP2 12 og kalpain 13 eller ioner som kalsium 14,15, kalium 16 og 17 klorid.
Mange slike biosensorer utnytte Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 for å gi avlesninger av endringer i biosensor konformasjon. FRET mellom "donor" og "akseptor" fluorophores skjer via en kort rekkevidde direkte dipol-dipol interaksjonhvor fluoroforer er vanligvis adskilt med mindre enn ~ 10 nm. Dermed påvisning av FRET indikerer nærhet av riktig merkede proteiner og dermed gir et middel for å lese ut protein-protein interaksjoner 20, slik som bindende eller oligomeriseringsprosessen – enten som sluttpunkt i anleggs celler eller som dynamiske hendelser i tidskurs målinger av levende celler. Ved å merke en passende molekyl konstrukt med både donor og akseptor-fluoroforen, er det også mulig å lese ut konformasjonsendringer – eller spaltning – av konstruksjonen via endring i FRET, og dette er grunnlaget for mange biosensorer 21. Målinger av FRET effektivitet kan gi informasjon om donor-akseptor avstand og befolkningen brøkdel av giver fluoroforer gjennomgår gnage. Dermed kan FRET-baserte imaging teknikker brukes til å kartlegge og kvantifisere molekylære interaksjoner i tid og rom, for eksempel for å belyse cellesignalisering prosesser 22. Automating slike bildeteknikker kan gi høy gjennomstrømning analyser basert på avlesninger av signalveier eller nettverk.
I HCA, gnage avlesning oftest implementert er spektral ratiometrisk bildebehandling, der endringer i forholdet mellom akseptor til donor intensitet er kartlagt. Mens denne tilnærmingen er lett gjennomført – og er tilgjengelig i mange kommersielt tilgjengelige multiwell plate lesere – kvantitative spektralt løst FRET målinger krever kalibrering av den spektrale respons av systemet 23. Dette omfatter spektral krysstale som følge av spektral-blø gjennom og direkte eksitering av akseptor så vel som overføringsegenskaper i instrumentet, og prøven (indre filtereffekt). I prinsippet innebærer dette måling av ekstra "kontroll" prøvene som er merket med enten donor-only eller akseptor-bare.
Fra slike spektrale Proporsjonellekspansjon FRET målinger, en effektiv FRETeffektivitet (produktet fra selve FRET effektivitet og fraksjon av FRETing donor / akseptor-molekyler) kan oppnås sammen med den relative andel av donor og akseptor-molekyler 24. Spectral proporsjonal FRET brukes ofte med unimolecular FRET biosensorer, der donor / akseptor støkiometri kan antas å være kjent. For å bestemme populasjons fraksjoner av FRETing donor og akseptor, for eksempel, for å oppnå en dose-respons-kurve, er kjennskap til den aktuelle FRET effektivitet som kreves. Dette kan oppnås ved å måle en positiv FRET kontrollprøve med kjente egenskaper eller ved å anvende en annen metode for å måle den FRET effektivitet, slik som akseptor fotobleking eller FLIM.
Ved å bruke fluorescens-levetiden avlesninger, kan FRET påvises og kvantifiseres ved måling av donor utslipps alene – fjerner behovet for spektral kalibrering og ytterligere kontrollprøver. Dermed kan FLIM FRET leselig sammenlignes mellom instrumenterog mellom forskjellige prøver – slik at data fra endoskopi eller tomografi av levende sykdomsmodeller 25 for å bli vurdert opp mot målinger av cellebaserte analyser. Ved å montere donor fluorescens forråtnelse profiler til en passende multi-eksponentiell modell som tilsvarer FRETing og ikke-FRETing donorpopulasjoner, FRET effektivitet og befolknings fraksjoner kan i prinsippet oppnås direkte uten ytterligere målinger. Disse betydelige fordeler, men kommer på bekostning av FLIM krever mer oppdagede fotoner per piksel enn spektralt løst intensitet bildebehandling – vanligvis hundrevis av fotoner er nødvendig for å oppnå en nøyaktighet på livstid bestemmelse av 10% ved montering til en enkelt eksponentiell modell, og når sittende fluorescens forfallet profiler til komplekse (multieksponensiell) modeller, antall oppdagede fotoner som kreves øker til tusen. Dette har konvensjonelt ført til lange innhentingstider (titalls til hundrevis av sekunder per felt av VIew) for FLIM, spesielt når du bruker tid korrelert enkelt foton telling (TCSPC) implementert med sekvensiell pixel oppkjøpet i laser scanning mikroskop. Forsøk på å øke avbildningshastigheten ved hjelp av høyere eksiteringsfrekvenser intensiteter kan føre til betydelige fotobleking og / eller fototoksisitet. Sammen med en mangel på passende kommersielt tilgjengelige instrumentering og dataverktøy, har dette hindret FLIM blir brukt i HCA for medisiner eller systembiologi, der hundrevis til tusenvis av synsfelt skal avbildes. Laserskanning TCSPC FLIM har blitt implementert i en automatisert multiwell plate mikroskop 26 for sekundær målinger følgende identifikasjon av "treff" av steady-state polarisering-løst fluorescens anisotropi bildebehandling 27, som kan nå lignende bildebehandlings hastigheter til spektral ratiometrisk avbildning 28 som den deler mange fordeler og ulemper. Fluorescens anisotropi bildebehandling utnytter nedgangeni fluorescens anisotrofien av akseptor i nærvær av FRET og er også følsomme for spektral krysstale (f.eks, direkte magnetisering av akseptor). Det krever kalibrering å gjøre rede for polarisering krysstale og gir ikke en direkte måling av FRET effektivitet.
For å realisere fordelene av FLIM for HCA, har vi jobbet for å ta opp spørsmål om hastigheten på bildeopptak og bredere tilgang til teknologi. Her gir vi en oversikt over åpen kildekode programvare og maskinvare komponenter som kan benyttes for å implementere automatisert raske FLIM multiwell plate kortleser som er beskrevet nedenfor, sammen med eksemplar FRET baserte-analyser. I vår tilnærming 29 er FLIM realiseres med vidvinkeltids gated avbildning ved hjelp av en gated optisk bilde forsterker (GOI), som er illustrert i figur 1 som kan gi raskere bildebehandling og lavere fotobleking enn enkeltstråleskanning TCSPC på grunn av parallell pixel interrogation. Vår openFLIM-HCA instrument kan gi uten tilsyn FLIM, krever bare noen få sekunder å innhente FLIM data oppdager noen 100 fotoner per piksel (avhengig av lysstyrken på prøve). Kombinert med den tiden som kreves for å flytte prøven fra forrige synsfelt, for å justere oppkjøpet innstillinger og for å opprettholde prøven i fokus, dette vanligvis resulterer i multibrønnplate innhentingstider av ~ 10 s per synsfelt 25,28. Optisk seksjonering kan implementeres ved hjelp av en kvasi-wide-feltet Nipkow ( "roterende disk») skanner 30.
For FLIM dataanalyse, har vi utviklet en åpen kildekode verktøy kalt FLIMfit 31 som er i stand til å raskt analysere multibrønnplate FLIM datasett på konvensjonelle PC arbeidsstasjoner og er en plug-in for Omero 32. FLIMfit gir global analyse (omtalt i kapittel 1.2) som gjør det mulig FLIM data som skal monteres til komplekse modeller med oNLY noen 100 fotoner per piksel under forutsetning av at fluorescens levetid komponentene er invariant over et bilde eller en region av interesse (ROI), derfor redusere antall oppdagede fotoner nødvendig, lys eksponering for prøven og bildefangsten. Kjører FLIMfit på en standard stasjonær PC, krever bare 10s sekunder av beregnings tid til å analysere datasett bestående av hundrevis av FOVs. Dermed både FLIM datainnsamling og analyse kan foretas på tidsskalaer som er praktisk for HCA.
openFLIM-HCA maskinvare
Vår gjennomføring av FLIM HCA består av seks nøkkelkomponenter: (i) en fluorescens mikroskop ramme med optisk autofokus; (Ii) en motorisert (xyz) mikroskop trinn; (Iii) en eksitasjon laserkilde; (Iv) et bredt felt tids gated FLIM system med gated optisk forsterker (GOI), forsinkelse generator og kamera; (V) en datamaskin for datainnsamling og analyse og (vi) en Nipkow-plate skannerenhet for optisk seksjonert bilde å undertrykke ute av fokus lys. Dette kan være viktig når avbildning svake signaler, f.eks fra FRET biosensorer på celleplasmamembran, som kan bli overbelastet av bidrag fra cytoplasma fluorescens eller bakgrunn fra dekk eller dyrkingsmedium. Time-gated FLIM data er ervervet ved å belyse prøven med ultra pulset eksitasjon stråling, bildebehandling fluorescens utslipp til photocathode av GOI og anskaffe en serie av CCD-bilder av fosfor i GOI for en rekke innstillinger for tidsforsinkelse på den optiske forsterker gate etter ankomsten av eksitasjon pulser. Ettersom tiden portforsinkelsen følgende magnetisering blir øket, blir fluorescens-signalet sett å redusere og rekken av tidsstyrte fluorescensintensitet bilder tatt på CCD danne datasettet som kreves for å analysere råte profiler av alle fluoroforer i synsfeltet . Den gating av GOI er synkronisert til magnetisering pulseneog, for rekken av CCD kjøp, blir forsinkelsen av tidsport i forhold til magnetisering pulser satt til en serie av økende verdier over det ønskede området. Denne synkroniseringen er oppnådd ved hjelp av forsinkelsen generator som består av en "fast forsinkelse box" (gi forsinkelser på opptil 20 ns i 1 ps trinn) og en "grov forsinkelse boksen" som gir forsinkelser med et minimum trinn på 25 ps.
For FLIM kan eksitasjon gis av noen lynraske laser. For enkelhets skyld har vi anvender typisk en fiber-laser-pumpet supercontinuum kilde som gir picosecond pulser avstembar over det synlige spektrum fra hvilken den passende eksitasjonsstråling kan velges for ethvert fluorofor ved hjelp av en motorisert filterhjul med forskjellige båndpassfiltre. Vanligvis bruker vi en gjennomsnittlig strøm på ~ 100-200 μW ved prøven med pulser ved 40 eller 60 MHz repetisjon rate. Slike eksitasjon krefter kan også bli gitt av lynraske laserkilder basert på frekvens dobling avmodus-låst titan dopet safir lasere. Legg merke til at en eksitasjon pulsvarighet under ~ 100 ps er tilstrekkelig for de fleste eksperimenter. Et andre motorisert filterhjul er utstyrt med filtre nøytral tetthet blir brukt til å regulere eksitasjon intensitet. For sikkerhet og komfort, kan eksitasjon strålingen bli levert via en optisk enkeltmodus fiber. De konfigurasjoner for bred-felt FLIM og optisk i snitt FLIM er presentert i figurene 2 og 3 respektivt. For flere detaljer om de nøyaktige komponentene som brukes, kan du gå til openFLIM-HCA wiki 33. En kopi av gjeldende deler liste er gitt i tilleggsmaterialet.
For vidvinkel FLIM, er eksitasjon stråling er nødvendig for å belyse hele synsfeltet så jevnt som mulig. For dette direkte eksitasjon laserstrålen til en holografisk "flosshatt" diffusor som er rotert ved 10-50 Hz til tidsgjennomsnitts laseren speckle, med planet til difvarmeelementet som avbildes på baksiden fokalplan for objektivlinsen mikroskop. Fluorescensen bildet fra utgangsporten av mikroskopet er videresendt til den fotokatode av GOI og fosforet av GOI (aktive område diagonal 18 mm) avbildes på sensoren av en avkjølt vitenskapelig CCD (chip størrelse 10,2 mm x 8,3 mm) kameraet ved hjelp av et par av kameralinser som gir en forstørrelse på 0,7. Systemet styres av en standard PC som har et grensesnitt til instrumenteringen ved hjelp av RS232 protokoller. I tillegg er en Arduino mikroprosessor benyttes til å styre en lukker i eksitasjonslyset banen som er lukket bortsett fra når CCD kamera er å skaffe FLIM data og til å registrere signalet fra en fotodiode som brukes til å måle den gjennomsnittlige strøm fra spektralt filtrert supercontinuum eksitasjon kilde. For optisk kåret FLIM, blir magnetiseringen laserstråling koplet inn i en enkeltmodus polarisasjons-opprettholdende optisk fiber som kan kobles direkte til den Nipkow platen skannerenheten, som shown i figur 3. Utgangen fluorescens bildet fra Nipkow skannerenheten videresendes på fotokatode av GOI og resten av systemet er den samme som for bred-felt FLIM.
openFLIM-HCA programvare
Den datainnsamling programvare er skrevet i μManager 34. Det gir full HCA datainnsamling funksjonalitet inkludert alternativer for å endre rekkefølgen brønnene av platen er avbildet, å tilegne seg tid kurs for alle FOV, automatisk opprettholde fokus under målingene og å kontrollere eksitasjon og emisjon filterhjul og dichroic veksler for automatisert flerfarget bildebehandling. Det er også mulig å kjøre en "Prøve" kjøp av fluorescens-intensitet for automatisk å identifisere og registrere posisjonene på egnede FOVs for en etterfølgende FLIM anskaffelse i henhold til kriterier, for eksempel, basert på intensitet. FLIM HCA data kan lagres som en serieav TIFF-filer, som en serie av OME-TIFF-filer (dvs. én per FOV) eller som en enkelt OME-TIFF-fil som omfatter alle data fra en multiwell plate. Mer informasjon og en detaljert beskrivelse av μManager programvaren kan bli funnet på openFLIM-HCA wiki 33.
Den dataanalyse programvare, FLIMfit 31, en åpen kildekode MATLAB-basert klient for omero bildedata management plattform 32, er i stand til å lese FLIM data fra en omero server eller fra datamaskinen disk, som vist i Figur 4. Det har blitt designet for å analysere data fra TCSPC eller wide-felttids gated FLIM instrumenter og gir mange muligheter til å passe data fra openFLIM-HCA inkludert montering på monoeksponensiell råte profiler, og å doble eksponentiell og høyere kompleksitet forfall profiler, inkludert modeller som polarisering-løst fluorescens forfallet profiler. Det kan også ta hensyn til faste og tidsvarierende bakgrunnssignaler og kan UTIisere seg en følsom rom-tid-instrument responsfunksjon (IRF) eller kan få plass ved hjelp av en idealisert IRF som kan være tidsforskjøvet på en bildeelement-messig basis av en mengde som er bestemt fra den fulle eksperimentelle IRF måling. En global tidsdifferansen (t 0) mellom IRF og en fluorescerende prøve kan bestemmes ut fra en måling av en fluorescens-standard. Romlige variasjoner i bakgrunnssignaler og IRF kan også tas i betraktning. FLIMfit er i stand til å passe FLIM data på en piksel-messig basis eller ved å bruke "global binning" eller "global passende" for å lette montering av FLIM data med beskjedne (hundrevis) foton tall til komplekse råte modeller.
Globalt binning innebærer å samle alle de oppdaget fotoner fra pikslene i en brukerdefinert ROI på hvert tidspunkt å gi tilstrekkelige fotonnumre for å muliggjøre montering til komplekse råte modeller. Avkastningen kan være hele synsfeltet (FOV), kan det være manuelt defined av brukeren, eller det kan bestemmes ved hjelp av bildesegmenteringsverktøy. ROI kan også defineres ved hjelp av masker som importeres til FLIMfit fra andre image segmentering programvare. For FRET applikasjoner, er det vanlig å bruke global binning for å passe til en dobbel eksponentiell modell for å bestemme fluorescens levetid komponenter som tilsvarer FRETing og ikke-FRETing giver fluorophores som antas å være romlig invariant over avkastning og deretter å montere på en pixel-messig basis med disse levetid komponent vales faste for å få den FRETing donor befolkningen brøkdel i hver piksel.
Global montering innebærer samtidig montering av levetids komponenter og FRETing donor populasjons fraksjoner piksel-messig over en hel FOV- eller på tvers av en FLIM datasett som kan omfatte flere FOVs, for eksempel, fra en for flere brønner plate eksperiment eller en tidsserie av fluorescens levetid bilder. Global montering er i stand til å utnytte den romlige variatipå av befolknings fraksjoner over hele bildet som er tapt i den globale binning tilnærming for å gi sterkere begrensninger på komponent levetid estimering – og derfor mer pålitelige resultater – riktignok på bekostning av betydelig mer beregning 35. FLIMfit raskt kan analysere multibrønnplate FLIM datasett med global montering på konvensjonelle PC-arbeidsstasjoner med, for eksempel, en for flere brønner tids-gated FLIM datasett, ervervet med fem tidsporter for hver av 394 FOV hver omfattende 672 x 512 piksler, krever bare 32 sekunder og 2 GB minne for å passe til en dobbel eksponentiell modell 31. Dette er oppnådd ved å benytte et adskillbart ikke-lineær minste kvadraters tilpasningsalgoritmen implementert ved hjelp av flertråds parallelle algoritmer for å muliggjøre effektiv skalering på flerkjerneprosessorer og den FLIMfit koden er optimalisert for å minimalisere minnebruk. Figur 5 viser et øyeblikksbilde av det grafiske brukergrensesnittet til FLIMfitog flere detaljer finner du på nettsiden gitt i referanse 36. Ytterligere informasjon om global montering og global binning kan bli funnet i referanse 31.
Følgende protokoll for FLIM HCA bruke vår openFLIM-HCA instrumentering og programvare kan tilpasses et bredt spekter av celle bildebehandling eksperimenter med FLIM avlesninger. Generelt, for flere brønner plate FRET eksperimenter bør være utformet for å omfatte duplikate brønner av positive og negative biologiske kontroller i tillegg til de forholdene som studeres. Her beskriver vi spesifikke implementasjonen for å utføre optisk kåret FLIM (se figur 3) av COS-celler som uttrykker FRET-konstruksjoner som består av det mTurquoise fluorescerende protein og Venus fluorescerende protein sammen med en kort peptidlinker. Her mTq32V, mTq17V og mTq5V FRET konstruksjoner (omtalt i Representant Resultater seksjon) gir lav, middels og høy FRET effektivitet sammen med den ikke-FRETing mTq5A konstruere.Disse konstruksjonene og andre materialer som kreves for å følge denne protokollen er oppført i Materials List.
Vi har beskrevet en automatisert multiwell plate mikroskop designet for HCA bruker tid-gated FLIM. Dette instrumentet styres ved hjelp av åpen kildekode programvare skrevet i μManager med mulighet for å lagre data til en Omero server og FLIM dataanalyse blir gjennomført ved hjelp FLIMfit 36, en åpen kildekode program skrevet i Matlab og tilgjengelig som en omero klient 32 μManager instrument kontroll programvare, openFLIM-HCA, er tilgjengelig på nettet 33 med en liste over de systemkomponenter 48 for å muliggjøre akademiske forskere til å konstruere sine egne FLIM HCA instrumenter.
For å skaffe robuste FLIM data, er det nødvendig å optimalisere GOI og CCD oppkjøp innstillinger og å ta hensyn til eventuelle variasjoner i t 0. Som beskrevet i 3.8.2, bør GOI forsterkningsinnstillingen og CCD-kamera integreringstiden settes til nå ~ 75% av CCD dynamisk område. Usynge høyere GOI spenninger og flere CCD ramme ansamlinger ved hvert tidsportforsinkelsen øker signal-til-støy-forhold 49, men dette øker den totale FLIM innhentingstiden (siden færre fluorescens-fotoner er ervervet for hver ramme før CCD kamera mettede og slik at antall ramme ansamlinger bør økes) og så denne avveiningen bør avgjøres for hvert forsøk. Kalibreringen av forsinkelsesgeneratoren avhenger av laserrepetisjonstakten, og det er derfor nødvendig å sikre at den riktige kalibrering fil for repetisjonsfrekvensen som brukes er lastet inn i anskaffelse programvare. Prosedyren for kalibrering av forsinkelsen boksen kan bli funnet på openFLIM-HCA wiki 33.
Dersom den cellulære autofluorescens er lav i forhold til den fluorescens-signalet, bruker vi signalet fra en brønn som inneholder bare kulturmedium for å tilveiebringe den tidsvarierende bakgrunn (TVB). For å minimere bakgrunnsfluorescensen fra cellekulturmediet, unngår vimedier som inneholder fenol rødt. Dersom den cellulære autofluorescens er vesentlig, da det TVB kan utledes fra målinger av de umerkede celler. Men i dette tilfellet hensyn må tas, da dette forutsetter at autofluorescens bakgrunn er det samme for hver piksel i bildet. Denne forutsetningen vil ikke være gyldig hvis autofluorescence varierer betydelig over en celle eller hvis eksitasjon bjelke eller følsomhet er ikke ensartet over synsfeltet.
Kjøpet av en IRF bilde ved hjelp av spredt eksitasjon lyspulser gir tinning IRF profil som er foldet med datamodellen i tilpasningsprosessen og gir også et kart over den romlige variasjonen av IRF over synsfeltet. IRF kan måles ved å avbilde et spredningsprøve, slik som en kolloidal suspensjon, selv om, i vårt instrument, ved hjelp av eksitasjonslys som spres fra den Nipkow disk gir en renere måling av IRF. Nøyaktig bestemmelse av tidspunktet of IRF er viktig fordi feil i tidsforsinkelsen mellom eksitasjon og tidsportstyring i betydelig grad kan påvirke tilpasningsprosessen, særlig når passende til komplekse eksponensiell desintegrasjon modeller. IRF anskaffet ved hjelp spredt eksitasjon lys er ikke akkurat det som er nødvendig for tilpasningsprosessen fordi den er spilt inn på eksitasjon bølgelengde i stedet for på fluorescensemisjonen bølgelengde, noe som kan påvirke sin timing, selv om den romlige variasjonen av IRF bør være den samme på begge bølgelengder. I tillegg kan den spredte IRF bli globalt forskjøvet i tid i forhold til den sanne IRF på grunn av en forskjellig optisk veilengde fra det spredende objekt, slik tilfellet er for en IRF anskaffet fra Nipkow disken i optisk kåret FLIM. Denne korreksjonen, t 0, som er det aktuelle globale tidsmessige skift som skal brukes til det oppkjøpte spredt eksitasjon lys IRF, er beregnet ut fra monoeksponensiell henvisning dye data som angitt i Protocol trinn 4.4. Følgende fargestoffer kan brukes for forskjellige eksitasjonsbølgelengdene: en 75 uM Coumarin 153 oppløsning i metanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan benyttes for eksitering i området 295-442 nm; en 75 pM Kumarin 6-løsning i etanol (ź ~ 2,43 ns 37) kan benyttes for eksitering i området 430-500 nm; og en 75 pM rhodamin B-oppløsning i vann (τ ~ 1,7 ns 37) kan benyttes for eksitering i området 488-575 nm. Vi merker oss at, selv om det er mulig i FLIMfit å bruke en annen IRF for hver piksel i systemet, vanligvis er det rimelig å gjøre antagelsen om at romlig varierende IRF har samme tidsmessige profil for hver piksel i bildet, men presenterer et utvalg av romlig varierende tidsmessige forskyvninger i forhold til den globale t 0. Vi beskriver dette som skift kart IRF, som bestemmes fra det spredte lys IRF. Sammen er IRF profil, t 0 og kart IRF skift brukes til ensørge for at hver piksel i FOV er utstyrt med en passende IRF. Viktigere, kan t 0 variere sakte over tid så det bør måles før FLIM datainnsamling.
Brukeren bør bestemme hvordan du vil prøve fluorescens forfall profiler og er nødvendig for å angi bredden av tids-porter og deres relative forsinkelser etter eksitasjon. Generelt er det ønskelig å anvende brede portbredde for å maksimere det detekterte signal, og vanligvis bruker vi portbredde satt til 4 ns for FLIM av celler merket med fluorescens-proteiner. Antallet tids-portforsinkelser bør være tilstrekkelig til å smake den fluorescerende forråtnelse profilen (inkludert en port innstilt til å måle signalet like før eksitasjonspulsen) gitt kompleksiteten av passende modell som vil bli brukt i analysen. Den optimale verdi kan avhenge av de relative levetider og amplituder for henfallsproduktene komponentene. Generelt, 4 portene er tilstrekkelig for montering monoeksponensiell avtar mens 7 eller flere porter kanbrukes til mer komplekse forfall modeller.
Vi merker oss at FLIM kan implementeres ved hjelp av en rekke tidsdomene eller frekvensteknikker og automatisert FLIM HCA av multibrønnplate matriser ble først implementert i en (ikke-seksjonering) wide-feltet mikroskop bruker frekvensområdet levetid avlesninger av FRET 51. Den første automatiserte optiske seksjonering FLIM flere brønner plateleser for HCA utnytte vidvinkel time-gated bilde 28 ble så rapportert. Deretter ble wide-feltet (non-seksjonering) frekvens domene FLIM HCA søkt å screene for posttranslasjonell modifikasjoner (tyrosinfosforylering) over et gen biblioteket ved hjelp FRET 52 og tids gated FLIM HCA har blitt brukt til å ergre analyser av HIV-1 Gag oligomerisering 53 og SUMOylation av FOXM1 54 og Raichu RhoA og Rac1 biosensorer 33. Det er også mulig å bruke TCSPC for multiwell plate FLIM 26, men hittil har det vist seg vanskelig å matche than gjennomstrømningen av teknikker som utnytter bredt felt gjenkjenning. En voksende tilnærming som kan løse dette problemet er bruk av matriser av enkeltfotontelling detektorer som SPAD arrays 55.
Vi registrerer at noen avlesninger av FRET bruker fluorescerende proteiner bør behandles med forsiktighet, og at de absolutte verdiene av parametrene hentet fra FLIMfit eller annen FLIM analyseprogramvare vil avhenge av forutsetninger knyttet til montering modell. For eksempel, hvor den FRET donor har en betydelig forråtnelse andre komponent, kan bruk av en modell bieksponensiell å passe FRET FLIM data resulterer i at bidraget fra raskere nedbrytning komponent, typisk assosiert med den FRETing befolkning vises høyere enn det burde. Det er derfor ønskelig å anvende givere med en mono-eksponentiell levetid slik som mTq2FP. Selv da, har nyere studier vist at FRET analyse kan likevel bli påvirket av mørke statene akseptor fluorescens proteiner eller vedheterogenitet av orienteringen faktor κ 2 på grunn av en fordeling av fluoroforen konformasjoner med en rekke kromofor vinkler og avstander 56. Likevel har vi og andre vist at fluorescens levetid avlesninger av FRET gjør gir brukbare resultater som korrelerer med biokjemiske målinger og kan brukes til å screene for protein interaksjoner eller for å følge dynamikken i biosensorer. Derfor er denne openFLIM HCA plattformen kan påføres på et vidt spekter av fluorescens levetid baserte analyser som anvender FRET eller cellulær autofluorescens 8, samt gi kvantitative avlesninger av fargestoffbaserte sonder 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |