Produção e Administração de Therapeutic-tronco mesenquimais / celular estromal (MSC) Spheroids condicionadas em culturas 3-D Sob Condições Xeno-livres
Summary
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
-Tronco mesenquimais / células do estroma (MSCs) são uma grande promessa em bioengenharia e medicina regenerativa. MSCs podem ser isoladas a partir de vários tecidos adultos através da sua forte aderência ao plástico da cultura de tecidos e, em seguida, ainda mais expandidas in vitro, mais comumente utilizando soro fetal de bovino (FBS). Uma vez que as MSCs de FBS pode causar a tornar-se imunogénico, a sua presença nas culturas de MSC limita ambas as aplicações clínicas e experimentais das células. (XF) media Portanto, estudos que empregam química definida livre de xeno para culturas MSC são extremamente valiosos. Muitos efeitos benéficos do MSC têm sido atribuídos à sua capacidade para regular a inflamação e imunidade, principalmente através da secreção de factores imunomoduladores tais como necrose tumoral gene estimulada por factor de 6 (TSG6) e prostaglandina E2 (PGE2). No entanto, MSCs requer ativação para produzir esses fatores e uma vez que o efeito de MSCs é muitas vezes transitória, grande interesse surgiu para descobrir maneiras de pré-activação das células prior para a sua utilização, eliminando assim o tempo de atraso para a activação in vivo. Aqui nós apresentamos protocolos para ativar de forma eficiente ou MSCs principais em três dimensões culturas (3D) sob condições XF quimicamente definidos e para administrar esses MSCs pré-activado in vivo. Especificamente, nós primeira descrevem métodos para gerar MSC esférica micro-tecidos ou "esferóides" em gotas de suspensão utilizando meio XF e demonstrar como as esferas e meio condicionado (CM) pode ser colhida para várias aplicações. Em segundo lugar, vamos descrever telas de expressão do gene e testes funcionais in vitro para avaliar rapidamente o nível de activação MSC em esferóides, enfatizando o potencial anti-inflamatório e anti-cancro das células. Em terceiro lugar, descreve-se um novo método para injectar esferóides MSC intactas dentro da cavidade peritoneal do rato in vivo para testes de eficácia. No geral, os protocolos aqui superar grandes desafios de obtenção de MSCs pré-activado sob química definida XF concondições e proporcionar um sistema flexível para administrar esferóides MSC para as terapias.
Introduction
-Tronco mesenquimais / células do estroma (CTM) têm mostrado grande potencial para várias abordagens de medicina regenerativa. MSCs foram inicialmente isolado como um componente do estroma de medula óssea, mas uma vez que foram obtidos a partir de numerosos outros tecidos adultos, incluindo o tecido adiposo 1, 2, 3. Curiosamente, o método de isolamento principal abraça a propriedade notável de MSCs de aderir firmemente ao plástico de cultura de tecidos na presença de soro fetal de bovino (FBS). Embora esta técnica de isolamento tradicional permite a expansão fácil e rápida das MSCs em bidimensional cultura (2D), é também muito artificial e ignora significado do ambiente nativo tridimensional (3D), conduzindo a potencial perda de importantes características celular 4, 5 , 6. Por conseguinte, o estudo das MSCs em culturas 3D, quesão mais fisiológica do que as culturas 2D tradicionais, surgiu na pesquisa "perdidos / diminuídas" características MSC. Além disso, grande interesse tem aumentado para identificar as condições (XF) livre de xeno química definida para a cultura MSC e ativação, e, assim, tornar as células mais favorável para aplicações clínicas.
Muitos estudos têm sido publicados demonstrando a cultura 3D de MSCs, tanto em biomateriais e como agregados esféricos ou esferóides. MSCs em biomateriais foram inicialmente concebidos para abordagens de engenharia de tecidos para substituir tecidos danificados com andaimes de células-semeado, enquanto culturas esferóides de MSCs foram vistos como uma maneira de entender o comportamento MSC in vivo após a administração das células para terapias em ensaios pré-clínicos ou clínicos 4, 5, 7. Curiosamente, MSCs formulário esferóides espontaneamente quando a adesão ao plástico de cultura de tecidos não é permitido8, 9, 10. Tradicionalmente, a agregação de células foi facilitada por métodos balão rotativo ou técnicas de sobreposição de líquidos, os métodos utilizados inicialmente na biologia do cancro nos esforços para tentar imitar o microambiente do tumor. Mais recentemente, métodos adicionais vieram à tona que demonstram a agregação de células em placas de cultura pré-revestidas com produtos químicos específicos para evitar a célula-a-plástico aderência 4, 5, 6. Um dos métodos mais simples e mais económica de produção esferóides MSC é a cultura deles em gotas de suspensão, uma técnica que foi usado frequentemente para produzir corpos embrióides a partir de células estaminais embrionárias. Com pendurado técnica de cultura gota, a adesão de células ao plástico de cultura de tecidos é evitada suspendendo as células numa gota de meio no lado inferior de uma tampa do prato de cultura de tecidos e permitindo que a gravidade para facilitar AGGREG célulação no ápice da gota. O tamanho do esferóide pode ser facilmente manipulada alterando a concentração de células ou o volume da gota, fazendo culturas de suspensão gota particularmente fácil de controlar.
Os primeiros estudos sobre a cultura 3D de MSCs demonstraram diferenças radicais nas características das células em 3D, em comparação com os seus homólogos 2D 6, 8, 9. Ao mesmo tempo, relatórios demonstraram que os efeitos benéficos de MSCs in vivo confiou na sua capacidade de se tornar activado por estímulos micro-ambientais e, em resposta, para produzir anti-inflamatória e imunomodulatória Factores 11. Interessantemente, muitos destes factores, tais como a prostaglandina E2 (PGE2), necrose tumoral gene estimulada por factor de 6 (TSG6), e factor de crescimento de hepatócitos (HGF) foi produzido em quantidades muito maiores por esferóides MSC do que as MSCs 2D tradicionais, abrindo o caminho para a ideia deutilizando culturas 3D para activar as células 8, 12, 13. Além disso, a activação de genes em culturas 3D apareceu recapitular mecanismos, pelo menos em parte, da activação das células após injecção em ratinhos 12. Ao activar as MSCs antes da sua utilização nas experiências, os efeitos das células poderia ser prolongada e mais proeminente como o efeito MSC tradicional in vivo é frequentemente adiada e transiente, e pode ser descrito como "bater e correr". Durante os últimos anos, estudos funcionais importantes que utilizam esferóides MSC demonstraram que eles podem suprimir as respostas inflamatórias e modular a imunidade in vivo, influenciando as células efectoras, tais como macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e células T fazendo esferóides de forma atraente de MSCs imunizadas 2 , 3. Além disso, a produção de moléculas de anti-cancro, tais como interleukin-24 (IL-24) e de necrose tumoral relacionado com o factor de indução de apoptose ligando (TRAIL), são aumentados em culturas em 3D de MSC em relação a monocamada MSCs, um fenómeno que pode ser explorada para terapias direcionadas 8, 10, 14.
À medida que a cultura MSC tradicional necessário não apenas a utilização de plástico de cultura de tecidos, mas também de FBS, um outro obstáculo para fazer esferóides MSC mais favorável para utilização clínica tiveram que ser superados. Para enfrentar este obstáculo, que recentemente mostrou a formação de esferóides MSC em condições específicas XF química definida e estabeleceu que os esferóides MSC resultantes foram ativados para produzirem as mesmas moléculas anti-inflamatórias e anti-câncer como os esferóides gerados em condições com FBS 14. Aqui, estes resultados são apresentados em vários protocolos detalhados que demonstram a geração de MSCs pré-activada em culturas 3D usando XFmeios de comunicação. Além disso, os protocolos são apresentados que descrevem modos eficazes para avaliar os níveis de activação das MSCs no que diz respeito aos seus efeitos anti-inflamatório, imunomoduladores e anti-cancro, em conjunto com um método prático para entregar os esferóides intactas em ratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O MSC ideal para uso em algumas aplicações de pesquisa e clínicos devem ser altamente activado para maximizar o seu benefício, e, preferencialmente, preparados em condições XF quimicamente definidos para minimizar a entrega de antígenos potenciais de componentes do meio xenog�icas como FBS. Nos protocolos descritos aqui, têm demonstrado que os métodos para 1) activar as MSCs em cultura 3D por formação de esferóides, 2) atingir a activação 3D das MSCs em condições XF, 3) avaliar os níveis de activa?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
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