大人ショウジョウバエの脳は神経回路、高次脳機能、および複雑な疾患を研究するための貴重なシステムです。小さなハエの頭から全脳組織を分析するための効率的な方法は、脳ベースの研究を促進します。ここでは、よく保存された形態を有する成人の脳の簡単な、ワンステップ解剖プロトコルを記述します。
、人間の脳変性疾患をモデル化し、成人の脳における神経回路網をマップし、高次脳機能の分子・細胞基盤を研究するためにショウジョウバエを使用することに関心が高まっています。よく保存された形態を有する成人の脳の全体のマウントの準備は、全脳ベースの研究のために重要であるが、技術的に困難と時間がかかることがあります。その後の処理工程を容易にするために、身体の残りの部分に結合して、無傷の脳を維持しながら、このプロトコルは、10秒未満で大人のフライヘッドの簡単に学ぶ、ワンステップ解剖のアプローチを説明します。手順は、通常、後撮像工程を妨害する可能性が脳に関連した目や気管組織の大部分を除去するのに役立ちますし、また解剖鉗子の品質にあまり需要を配置します。さらに、我々は、Bの両面を撮像するために重要であるカバーガラス上に取り付けられた脳試料の便利な反転を可能にする簡単な方法を説明します同様の信号強度と品質の雨。プロトコルの例として、我々はWTの大人の脳でドーパミン作動性(DA)ニューロンの分析を提示(1118ワット )飛びます。解剖法の高い有効性は、 ショウジョウバエの大規模な成人の脳ベースの研究のために特に有用です。
一般的にミバエとして知られているモデル生物ショウジョウバエは 、長い間そのエレガントな遺伝子ツール、短い生殖回、および高度に保存された分子および細胞経路のために評価されています。ミバエが正常に基本的なシグナル伝達経路、多細胞生物のパターン形成メカニズムだけでなく、神経発達のメカニズム、機能、および疾患1,2を分析するために採用されています。細胞標識およびイメージング技術の最近の進歩により、ショウジョウバエの脳は、神経回路の微細なマッピングで、そのような学習と記憶、および概日リズム1,3などの高次脳機能の分子および細胞基盤を解剖に特に強力になっています4,5,6,7,8。
ショウジョウバエシステムの1つの特定の利点は、通常の化合物または共焦点顕微鏡を使用して脳の全マウント調製および検査を可能にする、その比較的小さいサイズです。ティsの機能は、このように研究対象の全体像と全体内でのその正確なジオメトリの両方を提供し、全脳組織との関連で、細胞および細胞下レベルで、神経回路、または単一ニューロンの詳細な解剖学的および機能解析を可能にします脳。しかし、脳のかなり小型のサイズを考えると、それはまた、効率的な大人のハエで保護外骨格ヘッドケースのうち、無傷の脳組織を解剖における技術的な課題を提示しています。種々の効果的で比較的単純な切開方法は、通常、適切な脳9のヘッドケースの除去および目を含む関連した組織、気管、及び脂肪、10慎重伴い、段階的れ、詳細に記載されている。これらの顕微解剖法多くの場合、簡単に破損することができ、微細よく整列ヒントを鉗子に頼って、切開鉗子の品質にかなり厳しい要求を配置します。また、解剖脳は、多くの場合、separatあるとして体の他の部分から編、脳は簡単に、それらの小さなサイズと処理バッファでの透明性のその後の染色および洗浄プロセスの間に失われることがあります。ここでは、胴体に取り付けられた解剖頭脳を保ち、成人の脳のために、比較的単純かつ容易に習得できるワンステップ解剖プロトコルを記述します。解剖のプロセスは、多くの場合、簡単にそのような目や気管などの脳関連組織のほとんどを離れてクリアし、良質の解剖鉗子の需要が減少します。
蛍光化合物の顕微鏡や共焦点顕微鏡下で脳を撮像する場合に加え、離れ蛍光光源からである脳の側は、しばしば、ホールマウント脳の厚さに弱い信号の少ない鮮明な画像を生成します。ここで、我々はまた、同様の信号intensiと脳の両側の好都合なイメージングを可能にする、脳試料を容易に反転することができ、簡単な取付方法を説明しますTYと品質。
概念実証の成人の脳を研究するために、この方法の適用については、我々はさらに1118ハエワットの脳におけるDAニューロンの存在を調べました。多くの場合、多くのショウジョウバエの研究で、トランスジェニックハエおよび野生型コントロールを生成するための親株として使用されている遺伝子型。
人間の脳疾患、神経回路、および高次脳機能を研究するために大人ショウジョウバエの脳を使用して、関心の高まりと、大のために特に重要であるホールマウント分析し、無傷ハエの脳を得るために、簡単かつ迅速な方法を開発する必要があります脳ベースの画面を拡大縮小。我々の方法は、主に、関連組織からクリアされるよく保存形態で(多くの場合、経験を持つ10秒未満で)フ?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、プロジェクトへの巨大なサポートのために氏のENEメフメットさん、キアラ・アンドラーデ、さんピラール・ロドリゲス、クリス・クォック、およびさんダンナガーフィルを認めます。
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |