Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em> Drosophila</em> Brains

Summary

Der erwachsene Drosophila Gehirn ist ein wertvolles System zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, höhere Hirnfunktionen und komplexe Erkrankungen. Eine effiziente Methode ganze Hirngewebe von der kleinen Fliegenkopf zu sezieren werden Gehirn basierte Studien erleichtern. Hier beschreiben wir eine einfache, one-step-Dissektion Protokoll von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie.

Abstract

Es gibt ein zunehmendes Interesse Drosophila im Umgang mit menschlichen Gehirn degenerative Krankheiten zu modellieren, neuronale Schaltkreise in erwachsenen Gehirn abbilden und untersuchen die molekularen und zellulären Grundlagen der höheren Hirnfunktionen. Eine ganze Montage Vorbereitung von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie ist von entscheidender Bedeutung für eine solche ganze Gehirn-basierte Studien, kann aber technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine einfach zu erlernende, Ein-Schritt-Dissektion Ansatz eines erwachsenen Fliege Kopf in weniger als 10 s, während das intakte Gehirn zum Rest des Körpers angebracht halten nachfolgende Bearbeitungsschritte zu erleichtern. Das Verfahren hilft die meisten der Augen- und tracheale Gewebe entfernen, die normalerweise mit dem Gehirn verbunden, die mit dem späteren Abbildungsschritt stören kann, und stellt auch weniger Anforderungen an die Qualität der Pinzette. Zusätzlich beschreiben wir eine einfache Methode, die auf einem Deckglas praktisch Umklappen der montierten Gehirnproben ermöglicht, die zum Abbilden auf beiden Seiten der b wichtig istRegen mit ähnlichen Signalstärke und Qualität. Als ein Beispiel des Protokolls, wir eine Analyse der dopaminerge (DA) Neuronen in Gehirnen von erwachsenen WT präsentieren (w ¹¹¹⁸⁾ fliegt. Die hohe Wirksamkeit der Dissektion Methode macht es besonders nützlich für große erwachsenen Gehirn-basierte Studien in Drosophila.

Introduction

Der Modellorganismus Drosophila, die gemeinhin als die Fruchtfliege bekannt ist , hat für seine eleganten genetischen Werkzeuge, kurze Fortpflanzungszeiten, geschätzt und hoch konservierten molekularen und zellulären Wege lang sind. Die Fruchtfliege wurde erfolgreich eingesetzt grundlegende Signalwege zu sezieren, die Strukturierungsmechanismen von mehrzelligen Organismen, sowie die Mechanismen der neuronalen Entwicklung, Funktionen zugrunde liegen, und Krankheiten ^1,2. Mit den jüngsten Fortschritten in Zellmarkierung und Imaging – Technologien, hat die Fruchtfliege Gehirn besonders mächtig geworden in Feinkartierung der neuronalen Schaltkreise und in der molekularen und zellulären Grundlagen der höheren Hirnfunktionen zu sezieren, wie Lernen und Gedächtnis, und zirkadianen Rhythmus ^{1,3, 4,5,6,7,8.}

Ein besonderer Vorteil des Drosophila – Systems ist seine relativ kleine Größe, so dass ganze Montage Vorbereitung und Untersuchung des Gehirns eine regelmäßige Verbindung oder konfokalen Mikroskop. This-Funktion ermöglicht eine detaillierte anatomische und funktionelle Analysen der neuronalen Schaltkreise, oder auch nur ein einziges Neuron, auf zellulärer und subzellulärer Ebene im Rahmen einer ganzen Hirngewebe, so dass sowohl eine ganzheitliche Sicht des untersuchten Subjekts und seiner exakten Geometrie innerhalb der gesamten Bereitstellung Gehirn. Doch die eher geringen Größe des Gehirns gegeben, es stellt auch eine technische Herausforderung bei der effizienten ein intaktes Hirngewebe aus dem Schutz Exoskelett Kopf Fall bei einem erwachsenen Fliege sezieren. Verschiedene wirksame und relativ einfache Dissektion Methoden wurden im Detail beschrieben , die in der Regel vorsichtig beinhalten und stufenweise Entfernung des Kopfgehäuses und die damit verbundenen Gewebe , einschließlich der Augen, der Trachea und Fett aus dem Gehirn richtigen ^{9, 10.} Diese mikrochirurgische Dissektion Methoden oft legen eher hohe Anforderungen an die Qualität der Präparation einer Pinzette, mit feinen gut ausgerichteten Spitzen auf einer Pinzette verlassen, die leicht beschädigt werden können. Außerdem ist, wie die Gehirne seziert sind oft separatwegen ihrer geringen Größe und ihrer Transparenz im Verarbeitungspuffer ed von dem Rest des Körpers, kann die Gehirne leicht während der nachfolgenden Färbung und Waschverfahren verloren. Hier beschreiben wir eine relativ einfache und leicht zu erlernende, Ein-Schritt-Dissektion Protokoll für die erwachsenen Gehirn, die die seziert Gehirne an dem Rumpf hält. Die Dissektion Prozess löscht oft leicht die meisten der Gehirn-assoziierten Gewebe wie das Auge und die Luftröhre entfernt und verringert die Nachfrage nach guter Qualität Dissektion Pinzette.

Zusätzlich wird, wenn das Gehirn unter dem Fluoreszenzmikroskop Verbindung oder konfokalen Mikroskop Bildgebung, die Seite des Gehirns, die von der fluoreszierenden Lichtquelle weg erzeugt oft ein schwächeres Signal und weniger klare Bilder aufgrund der Dicke des gesamten Montage Gehirn. Hier haben wir auch eine einfache Montage-Methode beschreiben, die leicht Umklappen der Gehirnproben ermöglicht, so dass bequem Bildgebung von beiden Seiten des Gehirns mit ähnlichen Signal intensiviertenty und Qualität.

Als proof-of-concept für die Anwendung dieses Verfahrens das adulte Gehirn zu untersuchen, untersuchten wir ferner die Anwesenheit von DA – Neuronen im Gehirn von w ¹¹¹⁸ Fliegen; ein Genotyp , die oft als die Elternlinie verwendet wird transgenen Fliegen und die Wildtyp – Kontrolle in vielen Drosophila Studien zu erzeugen.

Protocol

1. Verwendete Lösungen für Gehirnsezierung und Immunfluoreszenzanfärbung Präparieren der erwachsenen Fliegen Gehirne in künstlichen zerebraler spinaler Flüssigkeit (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mM MgCl 2 und 10 mM Glukose. Vor der Verwendung der Gas aCSF mit 5% CO 2/95% O 2 für 10 bis 15 min und Spitze mit 2,5 mM CaCl 2. Sterilisieren der aCSF Lösung durch Filtrieren durch ein 0,22-um-…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Hauptverfahren für adulte Gehirn Dissektion, wie oben beschrieben , die Figuren 2 und 3 sind repräsentative Bilder von 3 Tage alten WT. (Genotyp: w 1118) erwachsenen Gehirnen Fliegen, die mit einem Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase (TH costained wurden in rot, in Figur farbigen 2 und weiß in 3), einem Marker allgemein zu bezeichnen DA – Neu…

Discussion

Mit zunehmendem Interesse an der Verwendung erwachsenen Drosophila Gehirn menschliche Gehirn Krankheiten zu studieren, neuronale Schaltkreise und höheren Hirnfunktionen, ist es notwendig , eine einfache und schnelle Methoden zu entwickeln , intakte Fliegen Gehirne für ganze-mount zu erhalten Analysen, die für groß besonders wichtig ist , skalieren Gehirn-basierte Bildschirme. Unser Verfahren bietet eine einfache und leicht zu erlernende Ansatz eine Fliege Kopf zu sezieren aus (oft in weniger als 10 s mit Er…

Materials

w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1	Bloomington Drosophila Stock Center	51652	Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950	Exelixis at Harvard Medical School	f01950	Balancer was switched to TM6C
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-003-990
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2)	Fisher Scientific	02-003-265
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G	Replaces glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size	Fisher Scientific	GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological)	Fisher Scientific	SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent	Fisher Scientific	02-003-823
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points	Fisher Scientific	17-456-055	Protocol does not require very fine points.
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	Pel-Freez Biologicals	P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav	The Developmental Studies Hybridoma Bank	Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Propyl gallate powder	Sigma-Aldrich	P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1	Zeiss	Quote
Zeiss Apotome.2	Zeiss	Quote
Zen lite software		Quote