Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em> Drosophila</emLos cerebros>
Summary
El adulto de Drosophila cerebro es un sistema valioso para el estudio de los circuitos neuronales, las funciones cerebrales superiores, y los trastornos complejos. Un método eficaz para diseccionar el tejido cerebral entera de la cabeza pequeña mosca que facilitará los estudios basados en el cerebro. Aquí se describe un protocolo de disección simple, de un solo paso de cerebros adultos con una morfología bien conservada.
Abstract
Existe un interés creciente en el uso de Drosophila para modelar enfermedades degenerativas del cerebro humano, el mapa circuitería neuronal en el cerebro adulto, y el estudio de las bases moleculares y celulares de las funciones cerebrales superiores. Una preparación de todo el montaje de los cerebros de adultos con una morfología bien conservada es fundamental para este tipo de estudios integrales basados en el cerebro, pero puede ser técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Este protocolo describe un enfoque disección de un paso fácil de aprender, de una cabeza de mosca adulta en menos de 10 s, mientras se mantiene el cerebro intacto unido al resto del cuerpo para facilitar las etapas de procesamiento posteriores. El procedimiento ayuda a eliminar la mayor parte de los tejidos del ojo y traqueales normalmente asociadas con el cerebro que puede interferir con la etapa de formación de imágenes más tarde, y también pone menos demanda de la calidad de los fórceps de disección. Además, se describe un método simple que permite flipping conveniente de las muestras de cerebro montados sobre un cubreobjetos, que es importante para obtener imágenes de ambos lados de la blluvias con intensidad de señal similar y la calidad. Como un ejemplo del protocolo, se presenta un análisis de las neuronas dopaminérgicas (DA) en cerebros adultos de WT (1118 w) vuela. La alta eficacia del método de disección hace que sea especialmente útil para los estudios basados en el cerebro adulto a gran escala en Drosophila.
Introduction
El organismo modelo Drosophila, comúnmente conocida como la mosca de la fruta, durante mucho tiempo ha sido valorado por sus herramientas genéticas elegantes, tiempos cortos reproductivos, y muy conservadas vías moleculares y celulares. La mosca de la fruta ha sido empleado con éxito para diseccionar las vías de señalización básicos, los mecanismos de modelado de los organismos multicelulares, así como los mecanismos que subyacen en el desarrollo neuronal, funciones, enfermedades y 1,2. Con los recientes avances en las tecnologías de etiquetado celular y de formación de imágenes, el cerebro mosca de la fruta se ha vuelto especialmente potente en mapeo fino de la circuitería neuronal y en la disección de la base molecular y celular de las funciones cerebrales superiores, como el aprendizaje y la memoria, y el ritmo circadiano 1,3, 4.5.6.7.8.
Una ventaja particular del sistema Drosophila es su tamaño relativamente pequeño, lo que permite todo el montaje preparación y el examen del cerebro usando un compuesto de regular o microscopio confocal. Thicaracterística s permite un análisis detallado anatómicas y funcionales de los circuitos neuronales, o incluso una sola neurona, a nivel celular y subcelular, en el contexto de un tejido de todo el cerebro, lo que proporciona tanto una visión integral del tema estudiado y su geometría exacta dentro del conjunto cerebro. Sin embargo, dado el tamaño miniatura en lugar del cerebro, sino que también presenta un desafío técnico en la disección de una manera eficiente el tejido cerebral intacto fuera de la caja protectora de la cabeza exoesqueleto en una mosca adulta. Varios métodos eficaces y relativamente simples de disección se han descrito en detalle, que por lo general implican cuidado y paso a paso la eliminación de la caja de cabeza y los tejidos asociados incluyendo los ojos, la tráquea, y grasa del cerebro adecuada 9, 10. Estos métodos de disección microquirúrgica menudo imponer exigencias más estrictas sobre la calidad de las pinzas de disección, apoyándose en unas pinzas finas con puntas bien alineados que se pueden dañar fácilmente. Además, como los cerebros disecados son a menudo separated del resto del cuerpo, el cerebro pueden perderse fácilmente durante los subsiguientes procesos de tinción y lavado debido a su pequeño tamaño y su transparencia en el tampón de procesamiento. A continuación, se describe un protocolo de disección de un paso relativamente simple y fácil de aprender, por cerebros adultos que mantienen los cerebros disecados unidos al torso. El proceso de disección a menudo desaparece con facilidad a la mayoría de los tejidos del cerebro asociada tal como el ojo y la tráquea y reduce la demanda de pinza de disección buena calidad.
Además, cuando la formación de imágenes del cerebro bajo el microscopio compuesto fluorescente o un microscopio confocal, el lado del cerebro que está lejos de la fuente de luz fluorescente a menudo produce una señal más débil y menos imágenes nítidas debido a que el espesor del cerebro todo el montaje. Aquí, también se describe un método de montaje simple que permite una fácil mover de un tirón de las muestras de cerebro, lo que permite formación de imágenes conveniente de ambos lados del cerebro con intensi señal similarTy y calidad.
Como una prueba de concepto para la aplicación de este método para estudiar el cerebro adulto, hemos examinado aún más la presencia de las neuronas dopaminérgicas en el cerebro de las moscas w 1118; un genotipo que se utiliza a menudo como la línea parental para la generación de moscas transgénicas y el control de tipo salvaje en muchos estudios de Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con un creciente interés en el uso de adultos Drosophila cerebro para estudiar enfermedades humanas, los circuitos neuronales del cerebro y las funciones cerebrales superiores, es necesario desarrollar métodos simples y rápidos para obtener cerebros de moscas intactas para análisis de todo el montaje, lo cual es especialmente importante para a gran escalar las pantallas basadas en el cerebro. Nuestro método proporciona una forma sencilla y fácil de aprender enfoque para diseccionar una cabeza de mosca (a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el Sr. Mehmet Enes, la Sra Kiara Andrade, Sra. Pilar Rodríguez, Chris Kwok, y la Sra Danna Ghafir por su inmenso apoyo al proyecto.
Materials
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
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