Genom-dækkende analyse af HDAC-hæmmer-medieret graduering af MicroRNA og mRNAs i B celler inducerede undergår klasse-skifte DNA rekombination og Plasma Celledifferentiering
Summary
Epigenetiske faktorer kan interagere med genetiske programmer til at modulere genekspression og regulere B-cellefunktion. Ved at kombinere in vitro B-celle stimulation, qRT-PCR, og høj overførselshastighed mikroRNA-sekvens og mRNA-sekvensen tilgange, kan vi analysere den epigenetiske graduering af miRNA og gen udtryk i B-celler.
Abstract
Antistof svar er udført gennem flere kritiske B celle-iboende processer, herunder somatiske hypermutation (SHM), klasse-skifte DNA rekombination (CSR) og plasma Celledifferentiering. I de seneste år, har epigenetiske ændringer eller faktorer, såsom Histon deacetylation og MicroRNA (miRNAs), vist at interagere med B-celle genetiske programmer på figur antistof reaktioner, mens dysfunktion af epigenetiske faktorer har vist sig for at føre til autoantistof svar. Analysere genome-wide miRNA og mRNA udtryk i B celler som reaktion på epigenetiske modulatorer er vigtigt for at forstå den epigenetiske regulering af B-celle funktion og antistof respons. Her viser vi en protokol for inducerende B-celler til at gennemgå CSR og plasma celle differentiering, behandling af disse B-celler med Histon deacetylase (HDAC) hæmmere (HDIs) og analysere mRNA og microRNA expression. I denne protokol, vi direkte analysere supplerende DNA (cDNA) sekvenser ved hjælp af næste generations mRNA sekventering (mRNA-seq) og miRNA-seq teknologier, kortlægning af Sekventeringen læser til genom og kvantitative reverse transkription (qRT)-PCR. Med disse tilgange, har vi defineret i B celler inducerede underkastes CSR og plasma Celledifferentiering, HDI, en epigenetisk regulator, selektivt modulerer miRNA og mRNA udtryk og ændrer CSR og plasma celle differentiering.
Introduction
Epigenetiske mærker eller faktorer, såsom DNA methylering, Histon posttranslationelle ændringer og ikke-kodende RNA’er (herunder MicroRNA), modulere cellefunktion ved at ændre gen expression1. Epigenetiske ændringer regulere B-lymfocytter funktion, som immunoglobulin klasse-skifte DNA rekombination (CSR), somatiske hypermutation (SHM) og differentiering til hukommelse B celler eller plasma celler, hvorved modulerende antistof og autoantistof svar2,3. CSR og SHM kræver kritisk aktivering-induceret cytidine deaminase (støtte, kodes som Aicda), som er yderst induceret i B celler som reaktion på T-afhængige og T-uafhængig antigener4. Klasse-skiftet/hypermutated B celler yderligere differentiere sig til plasmaceller, der udskiller store mængder af antistoffer i en mode kritisk afhængig af B-lymfocytter-induceret modning protein 1 (Blimp1, kodes som Prdm1)5. Unormal epigenetiske ændringer i B-celler kan medføre afvigende antistof/autoantistof svar, hvilket kan føre til allergisk reaktion eller autoimmunitet1,4. Forstå hvordan epigenetiske faktorer, såsom miRNAs, modulere B celle-iboende genekspression er ikke kun vigtigt for vaccine udvikling, men er også afgørende for at afsløre mekanismerne af potentielle unormale antistof/autoantistof reaktioner.
Histon acetylation og deacetylation er ændringer af lysin rester på Histon proteiner typisk katalyseret af Histon acetyltransferase (HAT) og Histon deacetylase (HDAC). Disse ændringer fører til stigende eller faldende tilgængeligheden af kromatin og yderligere tillade eller forhindre bindingen af transkriptionsfaktorer eller proteiner til DNA, og ændringen i genet udtryk5,6, 7 , 8. HDAC-hæmmere (HDI) er en klasse af stoffer, der forstyrrer funktionen af HDAC-enzymerne. Her, brugt vi HDI (VPA) vedrører regulering af HDAC på den iboende gen expression profil af B-celler og på dets mekanisme.
miRNAs er lille, ikke-kodende RNA’er ca 18 til 22 nukleotider i længde, der genereres gennem flere faser. miRNA vært gener er transskriberet og danne hårnål primære MicroRNA (pri-miRNAs). De eksporteres til cytoplasma, hvor pri-miRNAs behandles yderligere i forløber miRNAs (pre-miRNAs). Endelig, modne miRNAs dannes ved spaltning af pre-miRNAs. miRNAs genkender de komplementære sekvenser i den 3′ utranslaterede region af deres mål mRNAs6,7. Gennem post-transcriptional hæmning, regulere miRNAs cellulære aktivitet, såsom spredning, differentiering og apoptose10,11. Da flere miRNAs kan målrette den samme mRNA, og en enkelt miRNA potentielt kan målrette flere mRNAs, er det vigtigt at have en in-sammenhæng opfattelse af miRNA udtryk profil til at forstå værdien af enkelt og kollektive effekten af miRNAs. miRNAs har vist sig at være involveret i B-celle udvikling og perifere differentiering, samt B-celle stadium-specifikke differentiering, antistofrespons og autoimmunitet1,4,9. I 3′ UTR af Aicda og Prdm1er der flere validerede eller forudset evolutionært bevarede websteder, der kan blive ramt af miRNAs8.
Epigenetiske nedsættelser, herunder Histon efter transskription ændring og miRNAs, vise en celletype og celle fase-specifik forordning mønster af gen expression9. Her, beskriver vi metoder til at definere den HDI-medieret graduering af miRNA og mRNA udtryk, CSR og plasma Celledifferentiering. Disse omfatter protokoller for inducerende B-celler til at gennemgå CSR og plasma Celledifferentiering; til behandling af B-celler med HDI; og til at analysere miRNA og mRNA udtryk af qRT-PCR, miRNA-FF. og mRNA-seq10,11,12,8,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver omfattende tilgange for at fremkalde B-celle klasse switching og plasma Celledifferentiering; at analysere indvirkningen af epigenetiske modulatorer, nemlig HDI; og til at påvise effekten af HDI på mRNA og miRNA udtryk i disse celler. De fleste af disse metoder kan også bruges til at analysere virkningen af epigenetiske faktor på humane B-celle funktion og mRNA/miRNA udtryk. QRT-PCR og mRNA-seq/miRNA-seq tilgange kan også bruges til at analysere B celler isoleret fra mus behandlet med epigenetis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud AI 105813 AI 079705 (til PC), giver Alliance for Lupus forskning målet identifikation i Lupus Grant ALR 295955 (til PC), og gigt Grundforskningsfond forskning (HZ). TS blev støttet af Pediatrics Medical Center, anden Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Kina, i forbindelse med Xiangya-UT skole af medicin San Antonio medicinstuderende besøger program.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
- Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
- White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
- Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
- Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
- Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).
