이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.
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이 논문에서
요약
초록
신경계의 연결은 별개 형태의 엄청난 범위로 구성된다. 이러한 신경 세포의 소집단 다른 기능, 자신의 고유 한 수지상 형태학, 축삭 연결의 특정 패턴과 선택적 발사 응답 중 특징으로한다. 개발하는 동안 차별화의 이러한 측면을 담당하는 분자 및 세포 메커니즘은 여전히 저조한 이해된다.
여기, 우리는 라벨에 대한 결합 된 프로토콜을 설명하고 대뇌 피질의 신경 세포의 구조적 연결과 흥분을 특성화. 에서 자궁 전기 (IUE) 프로토콜의 수정은 뉴런의 스파 스 인구의 표시를 할 수 있습니다. 이것은, 차례로, 개별 돌기 신경 축색 돌기 층류 위치의 정확한 특성 및 형태 계측 학적 분석 축삭의 식별 및 추적 할 수있다. IUE 또한 흥분성의 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다야생형 (WT) 또는 전기 천공 두뇌의 급성 조각에서 전체 셀 녹음과 결합하여 유전자 변형 뉴런. 이 두 기술은 구조적 및 기능적 연결성의 결합에 대한 이해 및 개발 중에 신경 다이버 시티를 제어하는 분자 메커니즘에 기여한다. 이러한 발달 과정은 축삭 배선, 신경 세포의 기능 다양성,인지 장애의 생물학에 중요한 의미를 가지고있다.
서론
수지상 및 축삭 구조의 개발은 대뇌 피질에서 비롯한 신경계의 조절 회로의 중요한면이다. 또한 다양한 신경 세포 개체군의 선택 배선 동안 중요한 역할을한다. 최근 보고서 다수 연결 이외에 뉴런의 분자 다양성 소성 높은 특정 모드의 획득에 의해 반사되고, 그 보였다. 그러나, 개발 중에 별개 아형 신경의 흥분성 연결성 결정 메커니즘뿐만 아니라 배위 학위 여전히 잘못 2 1 이해된다.
생체 loss- 및 기능 획득하는 발현 유전자의 특정 레벨과 상기 회로의 개발에 대한 영향 사이의 관계에 대한 연구를 허용 분석한다. 자궁의 전기에서 (IUE)는 광범위하게 연구하는 데 사용하는 기술입니다특정 신경 인구에 대한 관심의 유전자의 기능과는 연결의 전체 패턴을 연구합니다. 그러나, 살아있는 생쥐의 대뇌 피질 층의 축삭과 수상 돌기의 형태 학적 특성을 결정하기 위해서는 띄엄 띄엄 뉴런 레이블을하는 것이 필수적이다. IUE와 결합 Cre 호텔 재조합 시스템은 식별 된 피질 박편의 개별 셀에 의해 방사 돌기를 해결하기 위해 충분히 낮은 밀도 뉴런 저밀도 인구를 표시하는데 사용될 수있다. 이 방법은 전기 천공....
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프로토콜
모든 동물의 절차는 국가 및 유럽 법률을 준수 마드리드 동물 관리 및 사용위원회의 지역 사회에 의해 승인되었다 (PROEX의 14분의 118; PROEX 15분의 331 참조). 절차 동안 멸균 상태를 유지한다.
1.에서 자궁 Electroporation에
참고 : IUE에 대한이 프로토콜은 이전에 5, 6, 7 게시 된 다른 사람들로부터 구성된다. 이 원고는 표준 GFP 기자 플라스미드를 사용하여 하나의 뉴런 (8)과 별도의 실험에서의 전기 생리 특성의 형태의 연구를 허용 기자 전략 수정과 함께 IUE E15.5의 배아에 대한 프로토콜을 설명합니다.
- DNA를 준비
- 제조업체의 지침에 따라 독소가없는 분리 키트를 사용하여 DNA 플라스미드를 준비하고 1 배의 페이지에서 그들을 희석포스페이트 완충 식염수 (PBS).
- 플라스미드가 대조군으로 형광성 단백질 리포터 (예 CAG-DsRed2
- 제조업체의 지침에 따라 독소가없는 분리 키트를 사용하여 DNA 플라스미드를 준비하고 1 배의 페이지에서 그들을 희석포스페이트 완충 식염수 (PBS).
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결과
상세 및 개발을 통해 신경 세포의 형태 학적 변화를 특성화하기 위해, 띄엄 띄엄 뉴런 레이블을하는 것이 필수적이다. 이 효소를 통합 만 신경 GFP (그림 1A)를 표현할 수 있도록 Cre 호텔 - 재조합 효소 희석 시스템은 뉴런의 스파 스 인구에 대한 관심의 유전자의 발현을 허용한다. 이 전략을 사용하여 레이어 II-III는 대상과 E15.5에서 IUE에 의해 표시된다. CAG-DsRed2는 / μL 1 μg의에서 공동 일렉트로 대조군으로 살아있는 동물에서 긍정적 인 일렉트로 머리를 식별하는 것입니다. 중요한 것은, 항 GFP 항체로 염색 한 후, 상기 신호는 수지상 모폴로지 및 축색 돌기 (도 1D 및 E)의 명확한 시각화를 허용하기에 충분히 강하다.
IUE 및 전기.......
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토론
이 프로토콜은 연결과 흥분을 분석하기 위해 C75BL / 6 마우스의 체성 감각 피질의 뉴런 레이블을하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 기존의 방법과 관련하여, 이러한 신경 세포 축삭 당 분기의 수, 정확한 지형 및 해부학 적 위치로 연결성 판별 측면을 가시화. 전극의 위치를 변경함으로써, 예에 cingulate 피질과 같은 다른 신경 세포 집단을 대상 (전극 뇌와 같은 각도를 유지하지만, 자극의 방향 변화) 또는 해마 5와 유사한 수행 할 수있다 원하는 전략에 따라 개별 뉴런 또는 광범위한 인구, 라벨 실험. 모든 집단이 동등 또는 동등 접근을 선택적으로 표시되어 그러나, 이것에 제한이있다. 예를 들면, 해마에서는, 선택적 CA1 영역의 후반 태생 뉴런을 타겟팅 할 수 있지만 EARLY 전기는 내부 및 외부 피라미드 세포의 이종 인구를 표시합니다. 대뇌 피질에서 신경 세포는 순차적으로 태어난, 그래서 IUE 동안 임신의 날은 영향을받는 대뇌 피질의 층을 결정한다. 이전 IUE 대상.......
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공개 사항
저자는 관심의 충돌을 선언합니다.
감사의 글
우리는 그들의 우수한 기술 지원 및 편집을위한 LA 바이스에 R. 구티에레스와 A. 모랄레스에 감사하고 있습니다. CGB는 스페인 Ministerio 드 Ciencia 전자 Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011에 의해 투자된다. 이 작품은 M. Navarrete은에 BBVA 재단과 SAF2014-58598-JIN (MINECO)에서 연구비와 라몬 Areces 재단과 보조금 SAF2014-52119-R과 (MINECO에서) BFU2014-55738 - REDT에에서 보조금에 의해 투자되었다 M. 니에 토.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| 패스트 그린 | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree 플라스미드 맥시 키트 | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| 이소플루란(IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| 케타민(Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| 자일라진(Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| 포비돈 요오 | 메다 | 694109.6 | |
| 눈 연고(Lipolac) | 안젤리니 | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 -Aldrich | P4333 | |
| 메스 핸들 # 3 - 12 cm | 파인 사이언스 도구 | 10003-12 | |
| 메스 블레이드 # 10 | 파인 사이언스 도구 | 10010-00 | |
| Adson 펜치 - 톱니 - 스트레이트 12 cm | 파인 사이언스 도구 | 1106-12 | |
| 경화 된 고급 가위-직선 11cm | 미세 과학 도구 | 14090-11 | |
| 가위 Mezenbaum-Nelson 곡선 L = 14.5cm | Teleflex | PO143281 | |
| 얇은 곡선 팁 - 스타일 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont # 5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu 바늘 홀더-톱니 모양 | 미세 과학 도구 | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9mm 자동 클립 | MikRon Precision, Inc. | ||
| 봉합사 - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| 전기 면도기 | Panasonic | ER 240 | |
| 붕규산 유리 모세관(100mm, 1.0/0.58 외경/내경) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 교정 미세모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리 | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| 면봉 (스타 코트) | Albasa-Needle | ||
| 25g (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| 자당 | 시그마 -Aldrich | S0389 | |
| 파라 포름 알데히드 | 시그마 -Aldrich | 158127 | |
| OCT 화합물 | 사쿠라 | 4583 | |
| 조직 배양 접시 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP 태그 다클론 항체 | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| 보조 항체, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 소 태아 혈청 | 써모 피셔 사이언티픽 | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| 전기포레이터 ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| 플래티넘 전극 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| 현미경 형광 이미징용 - MZ10F | Leica-VIP | ||
| 3000 Isofluorane Vaporizer | |||
| 레이저 스캐닝 시스템 | Leica-Axiovert | ||
| 200 현미경 | Zeiss-Cryostat | ||
| - CM 1950 | |||
| Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| 패치 클램프 분석 소프트웨어(p-Clamp Clampfit 10.3) | 분자 소자 | ||
| 수집 소프트웨어(MultiClamp 700B 증폭기) | 분자 소자 | DD1440A | |
| 전동 마이크로 매니퓰레이터 + 회전 베이스 | 셔터 기기 | MP-225 | |
| 에어 테이블 | Newport | - | |
| 소형 연동 펌프 | WPI | - |
참고문헌
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheri....
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재인쇄 및 허가
