우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)이 완전히 심근 (hiPSC-CMS), 내피 세포 (hiPSC-되는 EC), 및 평활근 세포 (SMCs)에 hiPSCs 차별화에 대한 관리 전에 특정 세포 유형,하지만 기존의 프로토콜로 분화해야합니다 자주 낮은 수율, 순도, 및 / 또는 가난한 표현형의 안정성에 의해 제한. 여기서는 신규 hiPSC-CM이, -ECs를 생성하기위한 프로토콜 및 -SMCs 실질적으로 종래의 방법보다 더 효율적이며, 물론 투여의 사이트를 통해 생성 된 사이토 카인 - 함유 패치 세포 주입을 조합하는 방법을 제시한다. 패치는 장기간 동안 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근에서 압착되는 세포 않도록 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 주입 된 세포의 보존을 모두 개선한다. 심근 허혈 재관류 손상의 돼지 모델에서 생착 속도가 클 때 두 배보다 더이었다세포는 세포 및 패치 모두 시토 킨 - 함유 패치없이 셀 비교 패치 및 치료 투여 아니라 단독 세포, 심장 기능 및 경색 크기에서 상당한 개선 연관되었다.
서론
들이 환자의 면역계에 의해 거부되지 않은 셀의 잠재적으로 무한 범위의 수로 구분 될 수 있기 때문에 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 재생 세포 치료에 가장 유망한 제제들이다. (SMCs을하지만, 자기 복제 및 분화 능력은 또한 종양 형성을 초래할 수 있으며, 결과적으로, hiPSCs 완전히 같은 심근 (CMS), 내피 세포 (EC에) 및 평활근 세포와 같은 특정 세포 유형으로 분화 될 필요 ), 투여 전. 세포 투여 간단하고 가장 일반적인 방법 중 하나는 직접 심근 내 주입이지만, 네이티브 심근 조직으로 이식 접목되는 세포의 수는 매우 낮다. 이 감소의 대부분은 허혈성 조직의 세포 독성 환경에 기인한다; 그러나, 생쥐 배아 줄기 세포 (는 ESC)가 있었을 때 손상되지 않은 마음의 심근에 직접 주입 O투여 된 세포의 상당한 비율이 그들이하는 동안 생성 된 높은 압력에 의해 바늘 트랙을 통해 압박했다 아마도 때문에 관리 사이트를 종료 제안 3-5 시간 1 일 동안 유지되었다 전달 된 5 백만 셀 할수 있답니다는 ~ 40 % 심근 수축.
여기, 우리는 hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS) 2, 내피 세포 (hiPSC-되는 EC) <....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 실험 절차는 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 가이드 라인에 따라 수행된다.
1. hiPSC-CM이에 hiPSCs 차별화
- 코트 밤새 4 ℃에서 사전 냉각 된 성장 인자 - 감소 된 젤라틴 단백질 혼합물로 6 웰 플레이트의 웰. 사용하기 전에 젤라틴 단백질 혼합물을 기음. 5 % CO 2, 10 μM의 ROCK 저해제와 37 ° C mTeSR1 중간 보충에있는 세포 (물론 당 1 × 10 5 세포를) 미리 코팅 된 플레이트 상에 hiPSCs 종자, 문화.
- 세포가 90 % 합류에 도달 할 때까지 매일 배지를 새로 고침; 다음, 5 % CO 2, 37 ° C 두 개 더 일 동안 매체 (0.5 mg을 젤라틴 단백질 6 웰 플레이트 당 혼합물, 잘 당 2 ㎖의 중간), 문화에 세포 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물을 추가합니다.
- 매체를 교체하려면, 부드럽게 진공 통해 페트리 접시에서 매체를 빨아아웃 셀을 터치하고, 전송 피펫을 사용하여 새로운 매체를 추가합니다.
- 보충 된 RPMI1640 배지 배지로 대체하여 분화를 시작하지 않고 인슐린 젤라틴 단백질 혼합물 B27를 성장 인자 - 감소, 100 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
차별화 된 hiPSC-CM이, -ECs 및 -SMCs의 특성
hiPSCs의 차동 용량 4, 2 (3)을 평가했다. 세포 계측법 최종 hiPSC-CM 인구의 순도가 90 % (그림 1A, 1B, 패널 B1)를 초과 할 수 있음을 시사 심장 트로포 닌 T (cTnT를) 식의 분석 흐름. 거의 모든 셀 느린 미오신 중쇄 (도 1b 패널 A1)을 표현 α-sarcomeric 액틴 (도 1b 패널 A2), 약 25 %의 미오신 경쇄의 2V 이성체 (MLC2v)을 표현하는 동안
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
hiPSC-CM이 향상된 수율 / 순도
의 CM으로 인간의 줄기 세포를 분화에 대한 기존의 프로토콜들은 종종 낮은 수율과 순도에 의해 제한된다 예를 들어, hESC의-CM이 단지 35-66% 느린 마이 오신 중쇄 또는 cTnT의 6 표현 퍼콜 분리 및 심장 몸 형성을 통해 획득했습니다. 분화 hiPSC-CM 인구의 순도는 대략의 프로모터에 결합되어 리포터 유전자의 발현을 위해 선택함으로써 증가 될 수있는 CM 특정 단백질 7, 8, 9, 그러나이 기술은 반드시 유전자 변형의 사용을 필요 특히 임상 연구에 대해 덜 바람직하다 세포. 여기에 제시된 프로토콜로, hiPSC-CM이 68 %가 cTnT를 표현하고, 순도는 이후 유전자 조작 또는 단일하지 않고 마이크로 해부 및 예비 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
감사의 글
이 작업은 미국 공중 보건 서비스 보조금 NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120 및 UO1 HL100407-project 4 (to JZ), 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금 (16SDG30410018) 및 University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ)의 Research Voucher Award의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | 피셔 사이언티픽 | 11875-119 | |
| 액티브빈 A | R& D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R& D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R& D | 232-FA-025 | |
| 콜라겐분해효소 IV | 피셔 사이언티픽 | NC0217889 | |
| 행크스 밸런스 염 용액(덱스트로오스, KCl, KH<서브>2PO<서브>4, NaHCO<서브>3, NaCl, Na<서브>2HPO<서브>4 무수) | 피셔 사이언티픽 | 14175079 | |
| 소 태아 혈청 | 피셔 사이언 | 10438018 | |
| 6웰 플레이트 | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm 접시 | Corning Lifescience | 354732 | |
| 세포 배양기 | Panasonic | MCO-18AC | |
| 프로토콜 섹션 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| 피브리노겐 | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 매체 | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV 매체 | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff 원심분리기 | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| 글루타르알데히드 | 시그마-알드리치 | G5882 | |
| 글리신 | 시그마-알드리치 | G8898 | |
| IGF | R& D | 291-G1-01M | |
| 소 혈청 알부민 | Fisher Scientific | 15561020 | |
| 가열판 | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| 수조 | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| 프로토콜 섹션 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-아미노카프로산 | 시그마-알드리치 | A0420000 | |
| MEM 배지 | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| 주사기 | Fisher Scientific | 1482748 | |
| 마취 인공호흡기 | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| 마취 인공호흡기 | Ohio Medical | V5A | |
| 제세동기 | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 모노필라멘트 봉합사 | Ethilon | 627H |
참고문헌
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a por....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
