Enda cell sekvense är ett allt populärare och tillgängliga verktyg för att ta itu med genomiska förändringar med hög upplösning. Vi tillhandahåller ett protokoll som använder en enda cell sekvensering för att identifiera kopietal förändringar i enskilda celler.
Detektion av genomiska förändringar vid en enda cell upplösning är viktig för att karakterisera genetiska heterogenitet och utveckling i normala vävnader, cancer och mikrobiella populationer. Traditionella metoder för att bedöma genetisk heterogenitet har begränsats av låg upplösning, låg känslighet och / eller låg specificitet. Enda cell sekvense har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att upptäcka genetisk heterogenitet med hög upplösning, hög känslighet och när lämpligt analyseras hög specificitet. Här ger vi ett protokoll för isolering, hela genomet förstärkning, sekvensering och analys av enskilda celler. Vårt tillvägagångssätt möjliggör tillförlitlig identifiering av megabas skala kopietal varianter i enstaka celler. Emellertid kan aspekter av detta protokoll också tillämpas för att undersöka andra typer av genetiska förändringar i enskilda celler.
Förändringar i DNA-kopieantal kan variera i storlek från flera baspar (kopieantal varianter) (CNVs) till hela kromosomer (aneuploidi). Kopietal förändringar som påverkar stora delar av genomet kan få betydande konsekvenser fenotypiska genom att förändra uttrycket av upp till tusentals gener 1, 2. CNVs som finns i alla celler i en population kan detekteras genom bulk-sekvensering eller microarray-baserade metoder 3, 4. Däremot kan populationer också vara genetiskt heterogena, med CNVs finns i en undergrupp av befolkningen eller ens enskilda celler. Genetisk heterogenitet är vanligt vid cancer, driving tumörutveckling, och även är närvarande i normala vävnader, med okänd konsekvens 5, 6, 7, 8, 9 <sup>, 10.
Traditionellt har genetisk heterogenitet bedöms antingen genom cytologiska metoder eller bulksekvensering. Cytologiska metoder, såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), kromosom uppslag och spektral karyotypering (SKY), har fördelen av att identifiera förändringar som förekommer i enskilda celler, men har hög felfrekvens på grund av artefakter för hybridisering och spridning 11. Dessa metoder är också begränsade i sin resolution endast avslöja antal kopior förändringar spänner flera megabaser. Sekvensering eller mikroarrayer bulk DNA, men högre noggrannhet och upplösning, är mindre känslig. För att upptäcka genetisk heterogenitet genom befolkningsbaserade strategier måste varianterna vara närvarande i en väsentlig del av cellerna i populationen. Uppkomsten av metoder för att förstärka den genom-DNA från enskilda celler har gjort det möjligt att sekvensera genomet av enskilda celler. Enda cell sequencing har fördelarna med hög upplösning, hög känslighet, och när lämpliga metoder för kvalitetskontroll tillämpas, hög noggrannhet 12.
Här beskriver vi en metod för att detektera megabas skala kopietal förändringar i enskilda celler. Vi isolera enstaka celler genom microaspiration, förstärka genomiskt DNA med hjälp av länk-adapter PCR, förbereda bibliotek för nästa generations sekvensering, och upptäcka kopietalet varianter av både dolda Markov-modellen och cirkulär binär segmentering.
Traditionellt, identifiera CNVs och aneuploidi vid nivån av enskilda celler som krävs cytologiska metoder såsom fisk och SKY. Nu har enda cell sekvense dykt upp som ett alternativt tillvägagångssätt för sådana frågor. Enda cell sekvense har fördelar jämfört med FISH och SKY eftersom det är både genomet bred och hög upplösning. Dessutom, när lämpliga metoder för kvalitetskontroll tillämpas, kan en enda cell sekvense ge en mer tillförlitlig bedömning av CNVs och aneuploidi eftersom det inte är mottagliga för hybridisering och spridnings artefakter inneboende FISH och SKY. Men många av de senaste tillämpningarna av en enda cell sekvense inte har styrkts genom noggrann bedömning av känslighet och specificitet metoder och analyser. Faktum är att några av de analytiska metoder som används av andra studier är förknippade med höga frekvenser (> 50%) falska positiva CNV samtal 12. Tillvägagångssättet beskriver vi har testats grundligt med celler av knegen CNV börda för att bestämma sanna och falska upptäckt priser och optimera känsligheten och specificiteten av CNV upptäckt 12. Använda kvalitetskontroll och analytiska metoder som beskrivs i detta protokoll, ca 20% av 5 Mb vinster, 75% av 5 Mb förluster, och alla CNVs överstiger 10 Mb kan upptäckas. Även om bestämning av falska upptäckten hastigheten för en enda cell sekvense är svårt, har vi uppskattat att det är mindre än 25%. Detta protokoll kan tillämpas på celler från en rad olika källor, kan skript ändras för att justera upplösningen av CNV upptäckt, och protokollet kan anpassas för att identifiera andra typer av genomiska förändringar.
Det finns en mängd olika medel för att dissociera färska vävnader in i enskilda celler, och många publikationer beskriver förfaranden optimerade för specifika vävnader, såsom hud 24 och hjärna 25. Vi föredrar att isolera enstaka celler genom microaspiration eftersom det tillåter fo r visuell bedömning av varje cell som skall sekvenseras. Det är emellertid också möjligt att isolera enstaka celler genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 26 och mikrofluidikanordningar 27. Om en enda cell isolering och hela genomet förstärkning sker manuellt, är det rimligt att isolera och amplifiera upp till fyrtio celler i ett enda sammanträde. För att få hög kvalitet enda cell sekvenseringsdata, är det viktigt att förstärkningen av encelliga genomen är enhetlig och fullständig. Vi finner att kvaliteten på enskilda celler isolerades liksom effektiviteten i lys och amplifiering har en betydande inverkan på kvaliteten på sekvenseringsdata. Som sådan bör cellerna skördas från sin ursprungliga miljö strax före isolering och hela genomet förstärkning bör inledas omedelbart efter det att cellerna isoleras. Dessutom bör lys och fragmentering steg följas exakt såsom beskrivits i steg 2,3-2,6.
"> Kan Algoritmerna justeras för att ändra upplösningen av CNV upptäckt, med motsatta effekter på sensitivitet och specificitet 12. Det är också möjligt att anpassa de trösklar för att upptäcka hela-kromosom aneuploidi i fastställandet av tetraploidy 11. Men finner vi att vår strategi är begränsad till att upptäcka CNVs större än 5 Mb, buller införas under hela genomet förstärkning komplicerar detektering av mindre varianter 12. Framtida förbättringar i hela genomet förstärkningsmetoder bör på sikt öka upplösningen av CNV upptäckt med hjälp enda cell sekvensering.Enda cell sekvense möjliggör undersökning av inte bara kopietal förändringar men också single nucleotide variationer 28, 29 och strukturell variation 30. Vår protokoll för enskild cell isolering kan användas för att besvara dessa andra questions. Men valet av hela genomet amplifieringsmetod beror på den specifika tillämpningen. Den metod som beskrivs i detta protokoll, som är baserad på polymerase chain reaction, är bäst lämpad för att upptäcka kopietal förändringar eftersom det är förenat med lägre förstärknings partiskhet 32. För att undersöka andra typer av genomiska förändringar, såsom single nucleotide polymorphisms är andra metoder för hela genomet förstärkning tros vara lämpligare 31, 32.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Stuart Levine för kommentarer om detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant GM056800 och Kathy och Curt Marble Cancer Research Fund till Angelika Amon och delvis av Koch-institutet Support Grant P30-CA14051. Angelika Amon är också en utredare av Howard Hughes Medical Institute och Glenn Stiftelsen för biomedicinsk forskning. KAK stöds av NIGMS Training Grant T32GM007753.
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177 | |
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) | VWR | 89068-500 | |
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) | VWR | 89068-508 | |
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 um) | VWR | 28144-040 | |
Serological pipette (5 ml) | BioExpress | P-2837-5 | Any plastic 5 mL pipette should suffice |
In-Line Water Trap for Oxygen Use | Amazon.com | 700220210813 | |
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) | VWR | 34502-99 | |
Modeling clay | VWR | 470156-850 | |
Petri dish (150 mm diameter) | VWR | 25384-326 | Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells |
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates | Bio-Rad | HSS9601 | Any 96-well PCR plate should suffice |
96-well tissue culture plate | VWR | 62406-081 | Any 96-well tissue culture plate should suffice |
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit | Sigma | WGA4 | |
Microseal 'A' Film | Bio-Rad | MSA5001 | |
Mini plate spinner | Thomas Scientific | 1225Z37 | |
Thermal cycler | Bio-Rad | 1861096 | Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate |
Agencourt Ampure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Dynamag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Any similar magnetic tube strip should suffice |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-121-1012 | |
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) | Kapa Biosystems | KK4845 | This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine. |