L'échelle du laboratoire: Production et purification d'un anticorps thérapeutique

Summary

Ce protocole décrit la production d'un anticorps thérapeutique dans un système d'expression mammalien. Les procédés décrits comprennent la préparation d'ADN vecteur, la transfection stable et l'adaptation d'une lignée de cellules embryonnaires de rein 293 humaine sans sérum, mis en place des cultures à grande échelle et la purification par chromatographie d'affinité.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

Le succès des anticorps thérapeutiques continue à conduire des investissements importants dans le développement d'anticorps comme une vague de produits thérapeutiques de prochaine génération commence. Le marché des anticorps à refaçonné par des fragments d'anticorps ^1, conjugués anticorps-médicament ^2, des anticorps bispécifiques ³ et des anticorps modifiés avec des propriétés favorables ^4. Une autre classe gagne intérêt pharmaceutique sont biosimilaires. anticorps biosimilaires sont «très similaires» répliquer les produits d'un anticorps thérapeutique qui a déjà reçu l'approbation réglementaire. Un biosimilaire proposé doit être comparable avec l'anticorps donneur par rapport à sa structure, la fonction, la toxicité animale, la sécurité clinique et de l' efficacité, la pharmacocinétique humaine (PK), pharmacodynamique (PD) et l' immunogénicité ^{5, 6.}

L'approbation rates d'anticorps biosimilaires ont été lents en raison des contraintes strictes sur la qualité finale du produit. Les procédés de fabrication spécifiques exactes, telles que des lignées cellulaires et conditions de culture à travers les dernières étapes de traitement peuvent rester propriétaire. Qui plus est, la fabrication d'anticorps implique intrinsèquement un degré de variabilité qui peut ajouter au défi de produire un produit très similaire. Une caractérisation et la comparaison physicochimique et biophysique global est assez difficile, mais un certain nombre d'études démontrant les caractéristiques des anticorps biosimilaires apparaissent dans la littérature ^{7, 8, 9.}

La génération d'un anticorps thérapeutique commence par la transfection de cellules hôtes de mammifère avec un vecteur portant des gènes de l'anticorps respectif. Vector design, les conditions de ligne et de la culture cellulaire sont des éléments essentiels pour la mise en place de l'exSystème de compression.

Les séquences d'ADN d'anticorps peuvent provenir de la Banque du médicament (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou de publications de recherche, y compris les brevets. Par exemple, la séquence de trastuzumab est disponible par le biais de la Banque Drug (DB ID: DB00072). La séquence d'acides aminés des régions variables peut subir une conception et une optimisation génétique pour la synthèse de l'espèce hôte souhaité. Il est important pour un anticorps biosimilar qu'aucune modification ne soit apportée à la séquence d'acides aminés. Une fois synthétisés, les gènes d'anticorps peuvent être sous-clonés dans le vecteur approprié de choix.

Les anticorps IgG humains se composent de deux chaînes lourdes identiques et deux chaînes légères identiques. Expression régulée Étroitement des deux chaînes est essentiel pour une production optimale de la protéine IgG hétérologue dans des cellules de mammifères ^10. Intra- ainsi que des liaisons disulfure inter-chaînes doivent être formées et un certain nombre de modifications post-traductionnelles doivent être entroduced pendant la biosynthèse des protéines. Un certain nombre de vecteurs sont disponibles qui ont été conçus spécifiquement pour exprimer des gènes d'anticorps (voir le tableau des matériaux). Ces vecteurs expriment des anticorps spécifiques à des régions constantes généralement à la fois des chaînes lourdes et légères de sorte que seules les régions variables de chaque chaîne nécessitent le clonage.

La transfection de cellules avec deux constructions indépendantes (co-transfection) est l'approche la plus courante pour la délivrance de gènes de la chaîne codant lourdes et légères. Autrement dit, chaque gène est entraînée par son propre promoteur et transcrit sous forme de chaînes d'anticorps séparées avant d'être assemblés dans le réticulum endoplasmique. D'autre part, des vecteurs multi-cistroniques comportent des éléments internes du ribosome entry site (IRES) incorporées qui permettent l' expression de gènes multiples comme un seul transcrit d'ARNm avec une traduction permise à partir de régions internes de l'ARNm ^11. Dans ce cas, les gènes codant pour des chaînes lourdes et légères sont couplées à une arrangEMENT pour réaliser la co-expression des deux chaînes d' anticorps ^{10, 12.}

Alors que les cellules produisent une protéine transfectées de manière transitoire suffisante pour effectuer un nombre limité d'expériences, des lignées de cellules transfectées de manière stable qui ont subi une sélection pour l'intégration du génome peuvent fournir des rendements plus élevés. Des quantités plus élevées de protéines permettent le développement de tests relatifs à la caractérisation in vitro peuvent fournir une indication de la qualité de l' anticorps en contrepartie des applications en aval telles que la lignée cellulaire clonale et la sélection des candidats au plomb.

Le but de cet article est de décrire l'expression stable et la purification d'un anticorps thérapeutique produite dans un système d'expression mammalien. En effet, cette méthode peut être appliquée à l'expression d'un anticorps biosimilar. La méthode peut être utilisée pour la caractérisation initiale des anticorps avant de procéder à la critique, mais ste de tempsps d'identifier un clone souhaitable pour agrandir la fabrication à grande échelle. En outre, ce procédé peut être utilisé pour exprimer d'autres protéines et non seulement des anticorps.

Le protocole détaillé ci-dessous décrit l'expression de thérapeutique trastuzumab d'anticorps. Il est composé de la préparation d'ADN vecteur, suivie par une transfection stable dans la lignée cellulaire HEK-293 et ​​la purification de la protéine d'anticorps par une méthode de chromatographie automatisée.

Protocol

NOTE: Un vecteur d'expression de mammifère approprié doit être utilisé pour ce protocole. Ici, une construction unique contenant deux cassettes d'expression est utilisée (c. -à- expression lourde et légère chaîne est entraînée par des promoteurs séparés). chaînes lourdes et légères trastuzumab ont déjà été clones dans le vecteur. Ce vecteur est un cadeau de Andrew Beavil, obtenu grâce à un bénéfice non-plasmide référentiel 13. 1. Recovery and Scale…

Representative Results

Production stable de trastuzumab par transfectées cellules HEK-293 a été confirmée à l' aide de bio-couche interférométrie (BLI) tel que présenté dans la figure 1. Une courbe standard d' IgG a été générée en mesurant le taux de liaison entre un niveau d'anticorps IgG et la protéine A biocapteur (figure 1A). L'échantillon de surnageant brut a été mesuré de manière similaire, alors que sa concentration interpolée à par…

Discussion

Ce protocole détaille la transfection, l'expression stable et la purification d'un anticorps thérapeutique dans les cellules HEK-293. L'expression stable des gènes d'anticorps est la première étape dans la génération d'une lignée cellulaire produisant des anticorps pour le développement et la fabrication d'un anticorps thérapeutique. Alors ovaire de hamster chinois (CHO) restent la plate-forme d'expression de choix pour les protéines thérapeutiques, la lignée cellulaire HEK-293 g…

Materials

pFUSE vector series	N/A	InvivoGen	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	N/A	ACYTE Biotech Pty Ltd.	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	N/A	Lonza	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	61883	Addgene	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	fas-hg-s	Jomar Life Research	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	fas-hg-l	Jomar Life Research	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	G6279	Sigma-Aldrich	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	G221020	Astral Scientific	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	R790-07	Life Technologies	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	12338-018	Life Technologies	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	K4894	Sigma-Aldrich	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
DMEM, high glucose	11995-065	Life Technologies
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	10082-147	Life Technologies
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	23966	Polysciences, Inc.	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use.
OptiPro SFM	12309-050	Life Technologies	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	ant-hg-1	Jomar Life Research
Dimethylsulphoxide (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Scientific
Tryptone (casein peptone)	LP0042B	Thermo Fisher Scientific	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	09-2051-100	Astral Scientific
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	GE17-0403-01	Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100	28406266	GE Healthcare	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	G2879	Sigma-Aldrich
Citric Acid, monohydrate	BIOC2123	Astral Scientific
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	BIOCB0035	Astral Scientific
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	BIOSD8146	Astral Scientific
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	UFC803008/UFC903008	Merck Millipore	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	23227	Thermo Fisher Scientific
BLItz System	45-5000	fortéBIO	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	18-5010	fortéBIO
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	786-502	Astral Scientific
Ammonium Persulfate (APS)	AM0486	Astral Scientific
TEMED	AM0761	Astral Scientific
Coomassie Brilliant Blue R-250	786-498	Astral Scientific
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	1610374	Bio-Rad